2020 Fiscal Year Annual Research Report
クルクミノイドの細胞内への取り込みの制御：疾病治癒への応用に向けて
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19J21566
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
板谷 麻由子 東北大学, 農学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2019-04-25 – 2022-03-31
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| Keywords | クルクミン / フリードラッグ仮説 / ピペリン / 抗炎症 / マクロファージ / ソリッドリピッドナノ粒子 / ポリ乳酸グリコール酸共重合体ナノ粒子 / Angiopep-2 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
初めに、【クルクミン(CUR)とピペリン(PIP)を共存させた際の抗炎症作用に対する影響】を評価した。THP-1マクロファージにPIPとCURを共投与した結果、仮説通りにCURの細胞移行量が増え、抗炎症作用が増加した。これにより、アルブミン(ALB)に対して強く結合する食品成分との共投与がCURの細胞移行量を増やし、生理作用を増大するという仮説が、昨年度実施した単球細胞だけでなく、他の細胞においても成り立つことを実証した。
次に、【生体内でもALBとCURの相互作用を抑制し、目的の細胞や臓器へのCURの取り込み量を増やすようなCUR・PIP含有ナノ粒子の作成と評価】を行った。文献情報をもとに、アミド結合によりAngiopep-2(AP2)をナノ粒子表面に修飾することを目指し、ナノ粒子内にカルボニル基を持つソリッドリピッドナノ粒子(SLNPs)の調製を行った。しかし、SLNPsは得られる粒子が不安定であり、収量が極めて少なかった。PLGANPsをコアとし、その表面にAP-2を修飾することを考えた。従来用いていたPLGANPsは、ナノ粒子を構成している分子内にカルボニル基を持たないため、代わりに架橋剤であるBS3をナノ粒子作成時に加え、AP-2をナノ粒子表面に結合させた。作成したナノ粒子をLRP-1を発現する細胞であるTHP-1マクロファージに処理し、蛍光顕微鏡で確認した。ImageJを用いて細胞内の蛍光強度を確認した結果、CURのみを含むPLGANPsでは、AP-2を修飾した場合と比較して4倍、CUR・PIPを含むPLGANPsでは、AP-2の修飾した場合と比較して2倍増加した。よって、AP-2による表面修飾はCURの細胞内取り込み量を増加する傾向がみられた。一方で、PIPによる共投与の影響は、NPs化していないものと比べて顕著な差を観察されず、この点の再試を予定している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
全体としてはコロナ禍の下、研究棟の閉鎖や実験時間の制限、試薬入手に大幅な時間の遅れがみられたことが理由として大きい。
実験内容に関して遅延が生じた要因としては2点ある。1点目は、SLNPsの調製に時間がかかったこと、2点目はRT-PCRでの評価法の確立に想定以上の時間を要したことである。SLNPsは複数の文献情報をもとに調製し、実験プロトコルの最適化を行った。しかしながら、いずれのプロトコルにおいても、遠心分離で目的のSLNPsが集まるとされる沈殿画分を回収したところ、約1 gの材料から回収できる沈殿画分の量はごく微量（1 mg程度）であった。これらのSLNPsを、動的散乱光分析や電子顕微鏡で粒子の大きさや形状を評価した結果、動的散乱光分析において、再現性の指標となりうる値が基準に満たず（PI値>1.2）、電子顕微鏡での観察において、SLNPsは球形が形成されていなかったことを確認した。実験プロトコル上、凍結乾燥処理により粒子が凝集し安定性が低くなる可能性を考慮し、賦形剤(マンニトール)の添加も試みたが、上記の問題は解決されなかった。代替方法として、現在取り組んでいるPLGANPsを活用した手法では、ナノ粒子の回収率は大幅に上昇し、かつ調製にかかる時間は短縮された。一方で、冒頭で述べた通り、材料として用いているPLGAの入手や、調製した粒子の評価に必須の分析機器を所持している外部研究機関への出張が制限されたことが、研究の遂行に遅れが生じた主な理由である。
また、RT-PCRによる評価では実験開始当初、研究室で用いられていたRT-PCR用ウェルの不適合により実験値が安定しなかったことや、炎症惹起による炎症性サイトカインの増加量が文献値を下回っていたこと等の課題があり、最適な実験条件の確立に想定していたよりも多くの時間を要したことが主な原因である。
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| Strategy for Future Research Activity |
コロナ禍で動物試験の実行が難しい中、来年度の研究計画として【ナノ粒子の評価の精密化】と【in vivoの系に代わるin vitroの系を用いた取り込みや生理作用の評価】を行っていく予定である。
前者では、分析化学的手法を用い、現行の手法でAP-2が確実にナノ粒子に結合することの実証を目指す。様々な論文において、修飾したペプチドが結合していることの証明には、細胞試験などを用いて目的とする機能性が増強するかを確認されていることが多い。これに対し、分析化学的にAP-2がナノ粒子に対して結合しているかを評価し、研究の精度を高める。AP-2をNPsに修飾するためには(1)カルボニル基末端を持つPLGANPsにNHS/EDCを用いてアミド結合をさせる方法と、(2)カルボニル末端を持たないPLGANPsの分散剤に架橋剤BS3を混合し結合させる2方法が用いられる。この2つの手法で作成したナノ粒子をそれぞれ、IRスペクトル/NMR/LC-MSを用いて、(1)アミド結合が形成有無の確認、(2)どちらの手法がより効率よくAP-2と結合しているかを評価し、効率よく目的の粒子が得られる手法を評価する。
後者では、昨年度に示したようにトランスウェルを用いた系を確立し、作成したNPsの機能性を評価する。AP-2はLRP-1をターゲットとするため、LRP-1を発現しかつタイトジャンクションを形成する細胞として、MDCK細胞を用いる。MDCKに対し、AP-2を修飾していない①CUR/②PIP/③CURPIP-PLGANPs処理し、AP-2を修飾したこれらの粒子と①透過量、②細胞への取り込み量をそれぞれ評価する。そののち、市販のBBBキットを用いて、in vitroにおける脳関門モデルのCURの投下量の測定や免疫細胞に対する抗炎症作用の評価を行う。
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