2020 Fiscal Year Annual Research Report
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）表面への抗原提示法を用いた次世代型ワクチンの開発
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19J21617
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
増田 亮津 九州大学, 生物資源環境科学府, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2019-04-25 – 2022-03-31
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| Keywords | ウイルス様粒子 / 次世代型ワクチン / カイコ-バキュロウイルス発現系 / 抗原キャリア / コロナウイルススパイク抗原 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、カイコを利用して高効率な抗原生産を可能なシステムを確立すると共に、ウイルス様粒子（V L P）上に生産した抗原をディスプレイすることで免疫効果の高い次世代型ワクチンを開発する事を最終目的とし、そのために以下の３つの計画に基づき、研究を進めている。
①ディスプレイ用抗原のカイコでの高効率生産
②九州大学のカイコ系統ライブラリーを利用したカイコの組換えタンパク質生産性の差異の原因探索
③異種タンパク質間の特異的架橋法を用いた抗原提示VLPワクチン作製
項目①については、人工的に三量体化させた豚流行性下痢病ウイルス（PEDV）のスパイク（S）抗原がマウスにおいて強い免疫応答を示し、PEDVの中和試験において高い中和抗体価を示すことが明らかになった。豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（PRRSV）のGP5抗原はsortaseによる発現の劇的な改善は見られず、発現改善のコンストラクト検討が引き続き必要である。②では、今年度は三量体化S抗原を用いてその発現差異を再び九州大学保存のカイコ系統を用いて調べたところ、S抗原の高発現系統と低発現系統が数種類ずつ確認され、現在RNA-seq用に系統間差の原因と関わる遺伝子を調べるサンプル調整を進めている。③では抗原ディスプレイをする土台としてノロウイルスVLPを本年度からは土台として用いた。修飾酵素MTGでの架橋では、抗原とVLPの連鎖反応が改善できなかったため、異なる架橋方法としてSpyTag-SpyCatcher systemを用いて、抗原とVLPを混ぜ合わせた所、特異的にノロウイルスVLPと三量体化PEDVS抗原を架橋することに成功した。これらは粒径解析とゲル濾過クロマトグラフィーにより、VLP上に抗原がディスプレイされていると思われる結果が得られている。現在、この抗原提示VLPを用いてマウスにおける免疫試験を進行中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
①三量体化モチーフを融合したPEDVS抗原の免疫原性を調べるため、マウスにS抗原を接種した所、免疫血清において非常に強い抗体応答が見られ、培養細胞を用いたPEDVの中和試験で、免疫血清が高い中和抗体価を持つことが明らかになったため、カイコで作られたS抗原がPEDVの感染を防御可能な抗体を誘導できることが示された。豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス(PRRSV)のGP5抗原はエクトドメインのN末端に可溶性・分泌性向上タグであるSortaseを融合することでカイコにおける生産性の向上を検討したが、不完全な形態のタンパク質が多く見られた。
② CMPを融合した三量体化Sタンパク質の発現のカイコ系統間差をカイコ血清において再検証し、S抗原の血清中における発現が比較的高い系統と低い系統が数種類ずつ確認した。組換えバキュロウイルス感染時の経時的な血中ウイルス量の変化を調べると、高発現系統と低発現系統でウイルス量に差があることを示唆する様な結果が出ている。
③ 本年度からは、カイコ-バキュロウイルス発現系で大量生産可能なノロウイルスVLPを抗原ディスプレイの土台とした。MTGによる酵素修飾法ではPEDVの三量体化S抗原とノロウイルスVLPが、昨年度と同様VLPと抗原の連鎖反応が起きていたため、S抗原に融合した精製用のタグ配列がMTGに認識されていると考え、それらの配列を除いて架橋を試みたが、連鎖反応の改善は見られなかった。そこで、新しくタンパク質間の特異的共有結合が可能なSpyTag-SpyCatcher systemを架橋に用いた。ノロウイルスVLPのC末端にSpyTagを導入し、SpyCatcherを導入した三量体PEDVS抗原と混合する事でそれらが特異的に結合され、架橋された状態でもVLPの状態を保っていることをDLSによる粒径解析とゲル濾過クロマトグラフフィーで確認した。
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| Strategy for Future Research Activity |
①三量体化PEDVS抗原に関しては豚での免疫試験に進み、実際の宿主においてのS抗原の免疫誘導能を検証する。PRRSVに関してはGP5抗原に現在カイコの発現系で発現改善の実績のある融合タンパク質を連結し、引き続き生産性向上の検討を行っていく。
②三量体化S抗原の血清中における発現が比較的高い系統と低い系統が数種類ずつに関して、現在、それぞれの系統の幼虫個体を組換えバキュロウイルス感染時と非感染時において脂肪体のRNAサンプルを調整中であり、RNA-seqによって遺伝子発現動態を解析することで、系統間のタンパク質生産性の差異とどの様な遺伝子が関連しているかを整理していく予定である。組換えバキュロウイルス感染時の経時的な血中ウイルス量の変化が高発現系統と低発現系統で異なることを示唆する結果が出ているため、ウイルスへの感受性に関連する遺伝子群を１つ着眼点としてRNA-seqのデータを解析してみる。
③ノロウイルスVLP上にSpyTag-SpyCatcher systemによってディスプレイしたサンプルは現在マウスにおいて免疫試験をしており、抗原単独投与と比べて免疫応答にどの様な違いが出るかを、主に接種量を減らしても十分免疫誘導できているかどうかという観点から検証していく。また、今回成功したSpyTag-SpyCatcher systemを用いて豚において問題となっている複数種の病原から最適なVLPと抗原のペアを作り、一度に複数種の感染症を免疫可能な多価ワクチン作製を視野に入れて研究を行っていく予定である。
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Research Products
(2 results)
