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2020 Fiscal Year Research-status Report

テルペノイドと油脂を高生産する海藻(褐藻)バイオリファイナリー

Research Project

Project/Area Number 19K05796
Research InstitutionIshikawa Prefectural University

Principal Investigator

河井 重幸  石川県立大学, 生物資源環境学部, 教授 (00303909)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 橋本 渉  京都大学, 農学研究科, 教授 (30273519)
三沢 典彦  石川県立大学, 生物資源環境学部, 教授 (30393466)
Project Period (FY) 2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords油脂蓄積酵母 / Yarrowoa lipolytica / バレリアノール / 油脂 / 褐藻 / アルギン酸 / DEH
Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、①油脂蓄積酵母(Yarrowoa lipolytica: Yli酵母)におけるHMG-CoAレダクターゼ(Yli酵母Hmg1)のリン酸化による活性制御機序を解明すること、②同機序に基づいてバレリアノールを高生産するYli酵母を構築すること、および③アルギン酸と硝酸塩からバレリアノールを高生産するYli酵母と油脂を高生産するYli酵母を構築することである。
当該年度は、①②に関しては、Yli酵母Hmg1の推定リン酸化部位(Ser-973とThr-977)を各々Alaに置換したHmg1_TA(Ala置換により細胞内でリン酸化されなくなると予想)ならびにYli酵母Hmg1を発現させるプラスミド、またはコントロール(ベクター)を保有するバレリアノール生産Yli酵母(前年度に構築)の生産するメバロン酸をHPLCで定量することで、これらのAla置換がHmg1活性に及ぼす効果を検証した。その結果、コントロールと比較して、メバロン酸量は増加していなかった(むしろ2割ほど低下していた)。すなわち、Ala置換には効果が無いことが分った。また、油脂合成経路の弱化による方法でもバレリアノールの高生産を試みるため、ターゲット遺伝子(Yli酵母ではylAcc1)の上流域(-550, -442, -135, -10の各々)をターゲットとするSTEPS法のプラスミドを保有する上記バレリアノール生産Yli酵母のメバロン酸量を定量したところ、-10領域をターゲットとした場合のみコントロール(pCRISPRy_Mix_yl)と比較してメバロン酸生産量が1.8倍増大していた。③に関しては、前年度構築したDEH資化能を示すYli酵母(Yli_DEH+株)の培養条件(使用窒素源)の選定、蛍光試薬Bodipy493/503を用いた油脂蓄積の可視化、生産された油脂のGC-MSによる分析を行った。ただし、適応進化によるDEH資化能の向上には至らなかった。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

①②に関しては、Hmg1のAla置換が効果が無いことが分ったものの、-10領域をターゲットとするSTEPS法が有望である可能性が示されたためかかる評価とした。
③に関してはYli_DEH+株)の培養条件(使用窒素源)の選定、蛍光試薬Bodipy493/503を用いた油脂蓄積の可視化、生産された油脂のGC-MSによる分析を進めた点を鑑み、かかる評価とした。

Strategy for Future Research Activity

①②に関して、-10領域をターゲットとするSTEPS法でメバロン酸分泌量が確かに増加していることを確認し、確証できればバレリアノール生産量が向上しているかをGC-MSで分析する。
③に関しては、DEHから合成された油脂の成分および量を、グルコースからの場合と比較しつつGC-MSで明らかにする、DEHとグルコースの消費速度を比較する、pex10の破壊、DGA1の大量発現、Leu2、Ura3の発現等で油脂生産量を向上させる。

Causes of Carryover

当該助成金が生じた状況1:設置予定であった(1)ブロッティング装置を設置しなかった。
翌年度分として請求した助成金と合わせた使用計画:(1)は設置予定。他は、特に物品費として油脂、バレリアノールの分析や遺伝子操作に要する主に物品費として援用し、目的達成に万全を期す。

  • Research Products

    (3 results)

All 2020

All Journal Article (3 results) (of which Peer Reviewed: 3 results,  Open Access: 2 results)

  • [Journal Article] Hsp104-dependent ability to assimilate mannitol and sorbitol conferred by a truncated Cyc8 with a C-terminal polyglutamine in Saccharomyces cerevisiae2020

    • Author(s)
      Hideki Tanaka, Kousaku Murata, Wataru Hashimoto & Shigeyuki Kawai
    • Journal Title

      PloS one

      Volume: 15(11) Pages: :e0242054

    • DOI

      10.1371/journal.pone.0242054

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Polyunsaturated fatty acids-enriched lipid from reduced sugar alcohol mannitol by marine yeast Rhodosporidiobolus fluvialis Y22020

    • Author(s)
      Shota Nakata, Mamoru Hio, Ryuichi Takase, Shigeyuki Kawai, Daisuke Watanabe & Wataru Hashimoto
    • Journal Title

      Biochem. Biophys. Res. Commun.

      Volume: 526(4) Pages: 1138-1142

    • DOI

      10.1016/j.bbrc.2020.04.032

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] 褐藻の主要多糖類アルギン酸の分解物が示す特定アミノ基との反応性2020

    • Author(s)
      河井重幸、橋本 渉
    • Journal Title

      バイオサイエンスとインダストリー

      Volume: 78(5) Pages: 396-397

    • Peer Reviewed / Open Access

URL: 

Published: 2021-12-27  

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