2019 Fiscal Year Research-status Report
Digestion, absorption and biological activity of phytoceramide 1-phosphate in vegetables.
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19K05863
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
田中 保 徳島大学, 大学院社会産業理工学研究部(生物資源産業学域), 教授 (90258301)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | スフィンゴ脂質 / 野菜 / 消化吸収 / セラミドリン酸 / グリコシルイノシトールセラミド / セラミド / ホスホリパーゼD |
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| Outline of Annual Research Achievements |
スフィンゴ脂質は形質膜におけるラフトの主要成分であり、髄鞘や皮膚の角質の健全性に欠かせない脂質である。以前、我々はキャベツの若い葉やダイコンを磨り潰すことでファイト型セラミド1-リン酸(PC1P)が生じることを明らかにした。このスフィンゴリン脂質の生成量は総リン脂質の５％に達する。PC1Pは食事性脂質の１つであるが、その消化吸収や体内動態はわかっていない。本研究ではPC1Pの消化、吸収、循環血中への移行性とPC1Pの動物細胞機能に及ぼす効果の解明を目的とした。2019年度には以下の成果を得た。
１）グリコシルイノシトールホスホセラミド(GIPC)はPC1Pの前駆リン脂質で野菜に含まれる最も豊富なスフィンゴリン脂質である。しかし、PC1Pと同様に、GIPCの消化吸収性はほとんど知られていない。我々はGIPCとPC1Pの単離法を確立した。GIPCは水とヘキサンを飽和させたイソプロパノールで効率的に抽出され、セファデックスカラムクロマトグラフィーで粗精製した後、TLCを行うことでGIPCを単離することができた。一方、PC1Pは通常の脂質抽出法であるBlighとDyerの方法で抽出でき、TLCを用いて単離することができる。想定されるPC1Pの消化物のファイト型セラミド（PCER）のTLCによる分離検出も可能とした。さらに、LC/MSによるPC1PおよびPCERの分析を可能とした。
２）GIPCおよびPC1Pの物理化学的安定性について調べた結果、PC1Pが熱や酸に比較的安定であるのに対し、GIPCはpH１以上の強い酸で分解され、胃酸による分解の可能性が示唆された。
３）PC1Pの生理作用（細胞遊走）
PC1Pの肺線維芽細胞を用いた遊走試験を行った。動物型セラミド1-リン酸(C1P)が数μMで細胞遊走を促進するのに対し、PC1Pは促進も阻害もしないことが明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究における当初の研究対象はPC1Pのみであったが、その前駆体であるGIPCも栄養学的見地からの研究が成されていないことが判明し、これら２つの植物性スフィンゴリン脂質の消化吸収性を調べることとした。PC1PもGIPCも天然には比較的豊富な植物スフィンゴリン脂質であるがその標品は市販されていない。2019年度はこれらのリン脂質の単離方法を確立することができた。また、GIPCやPC1Pの消化物として想定されるファイトセラミド(PCER)の単離も可能となっている。定量法は、GIPCおよびPC1Pについてはリン脂質の定量法に汎用されるリンモリブデン法が適応可能であった。一方、PCERの定量方法としてはTLC上で発色させた後、イメージJを用いた発光強度法を用いて半定量的に定量できるようになった。微量定量法として、PC1PおよびPCERについてLC/MSによる定量について検討中である。これらの定量方法を次年度から行う培養細胞および生体を用いたGIPCおよびPC1Pの消化吸収実験に応用する。
PC1Pについては動物アナログのC1Pが有するような細胞遊走促進活性は持たなかったが、C1Pで報告されているようなアポトーシス抑制活性を示す可能性があり、今後検討を行う。
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| Strategy for Future Research Activity |
2019年度の検討により、植物スフィンゴリン脂質のGIPCとPC1P標品が得られ、分析が可能になった。次年度は消化吸収実験に移行する。まず、PC1Pは小腸粘膜に存在するアルカリホスファターゼ（AP）で消化される可能性がある。予備実験ではPC1PがPCERに消化されることを確認している。より詳細にグリセロ型アナログであるホスファチジン酸(PA)との比較から検討を行う。具体的には、Km値やVmaxの測定による酵素との親和性や酵素活性の最大速度を調べる。また、PC1PのPCERへの消化は脂質リン酸ホスファターゼ(LPP)が行う可能性がある。LPPの酵素標品は市販されていないため、実験動物より得た小腸粘膜組織や膜画分とのインキュベートによる消化性、小腸由来の培養細胞Caco2細胞とのインキュベートによって調べる。AP活性とLPP活性のどちらの酵素活性がよりPC1PからPCERの変換に寄与しているかを調べるためは、例えば小腸粘膜から得られた粗酵素液（13k上清など）を中性（LPPが支配的）とアルカリ性（AP）でPC1Pと反応させ、それぞれの条件における活性の強弱から推定する。
PC1Pの吸収性は小腸粘膜細胞のCaco2細胞を用いて調べる。一定時間インキュベートした後、培養上清、細胞内におけるPC1PおよびPCERを定量することで消化と吸収を調べる。また、Transwellを用いた実験を用い、細胞取り込み後基底膜側への排出についても調べる。
GIPCの消化性は小腸粘膜組織とGIPCとのインキュベートを行い、消化物としてPC1PやPCERが生じていないかを調べる。
これらの知見を実験動物を用いたin vivoの消化吸収性および体内動態の解析に用いる。
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| Causes of Carryover |
理由：購入したゲルろ過カラム（ProteoSEC Dynamic）が３月の納品となり、支払いが完了していないため。
使用計画：ゲルろ過カラム（ProteoSEC Dynamic）の支払いは４月に完了する予定である。
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Research Products
(7 results)
