2019 Fiscal Year Research-status Report
運動による骨格筋由来エクソソームの制御および機能変化の解明
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19K06442
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| Research Institution | Toyo University |
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Principal Investigator |
根建 拓 東洋大学, 生命科学部, 教授 (50375200)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
宮西 伸光 東洋大学, 食環境科学部, 教授 (80372720)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 骨格筋 / エクソソーム / miRNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
運動は骨格筋自身のみならず、周辺や遠隔組織/器官にも影響を与える。これらの骨格筋と他組織/器官のクロストークの一部に骨格筋分泌タンパク質（マイオカイン）が関与していることが示唆されてきたが、マイオカイン以外の骨格筋分泌因子の関与については不明な点が多く残っている。本研究では、骨格筋から分泌される細胞外小胞の一種であるエクソソームに着目し、運動などの刺激に応じた動態変化や生理作用を明らかにすることを目的としている。
本年度は、まず本研究計画に沿って、骨格筋細胞C2C12培養上清から超遠心法を用いてエクソソーム（骨格筋エクソソーム）を精製し、TEM, DLS, WBなど多面的な方法で精製度確認を行った。エクソソーム放出動態について収縮刺激の効果を解析したところ、収縮によって放出エクソソーム径が変化する可能性を見出した。次世代シーケンサーによる精製エクソソーム内包miRNAを解析した結果、収縮刺激依存的に含有量が減少するmiRNAを5種（miR-A～E）同定することに成功した。
次に収縮依存的なエクソソーム変動の生理的意義を検討した。まず骨格筋エクソソームが筋芽細胞に伝達されることを細胞生物学的手法によって確認した後、エクソソーム添加後の細胞応答を観察したところ、収縮刺激依存的に放出されたエクソソームは筋芽細胞の筋分化関連遺伝子の発現を調節することが分かった。さらに、上記網羅的解析で同定されたmiR-A～Eが直接的に筋分化に関わっているかを調べた結果、骨格筋細胞内でmiR-Cの機能阻害を行うことで筋分化が抑制されることが明らかとなった。すでにmiR-Cが骨格筋分化を制御するmiRNAであることは知られていたが、本研究によって収縮依存的に放出される骨格筋エクソソームではmiR-Cの内包量が減少しており、筋芽細胞に伝達されることで筋分化を抑制することが初めて明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
骨格筋エクソソームの精製および収縮刺激依存的な動態変化については、研究計画の予定以上に進捗している。網羅的な含有RNA解析について予定通り実施、特に同定したmiR-C（骨格筋の分化や発達に関与していることが報告されている）については、令和2年度以降に予定していた収縮によるエクソソーム内包量変動の生理的意義についても研究を実施、極めて興味深い知見が得られた。タンパク質分析および表面糖鎖構造解析についても順調に進捗しており、エクソソーム内包タンパク質の二次元電気泳動および質量分析による解析系の構築は既に完了、データ取得を始める段階である。表面糖鎖構造解析についてはPA化法による糖鎖分析によって収縮依存的なエクソソーム表面糖鎖分布の変化が確認されたが、若干感度の問題が残っているため現在permethylationによる解析を試行している。以上、総合的に、おおむね順調に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究計画に沿って、収縮依存的な骨格筋エクソソームの動態変化およびその生理的意義に関する研究を継続する。特に生理的意義については、既に明らかになった筋芽細胞に対する影響のみならず、皮膚細胞・血管内皮細胞に対する効果を調べる。皮膚細胞については、エクソソーム依存的な真皮線維芽細胞のコラーゲンやヒアルロン酸産生、表皮角化細胞の増殖・遊走などを、血管内皮細胞については、増殖・細胞死・管腔形成能などを調べる。COVID-19感染拡大によって、予定していたリヨン第一大学、フランス国立科学センター（CNRS）との共同研究については実施が遅れる可能性もあるが、必要な代替策を取る予定である。
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| Causes of Carryover |
2020年2～3月にDLSによる骨格筋エクソソームの追加解析、骨格筋エクソソーム糖鎖の構造解析を予定していたが、COVID-19感染拡大に対応するため一部研究が実施できず、次年度使用額が生じている。これらの研究は、研究実施機関での研究再開が可能となった段階で速やかに実施する予定としている。
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