2019 Fiscal Year Research-status Report
細菌Ⅲ型分泌装置構成因子が受ける新奇な翻訳後多段階プロセシングの分子機構
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19K06562
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
檜作 洋平 京都大学, ウイルス・再生医科学研究所, 助教 (70568930)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 大腸菌 / べん毛 / III型分泌装置 / Rhomboid / 膜内切断プロテアーゼ / in vivo光架橋法 / kinetics解析 / FRET |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、申請者が複数の「切断」と「修飾」という翻訳後多段階プロセシングを受けることを予備的に見出した細菌べん毛III型分泌装置構成因子FliOを材料として、(A)膜内切断プロテアーゼGlpGによるFliO切断の構造学的、酵素学的原理を解明するとともに、(B)FliOの新奇なアシル化修飾を触媒する未知の酵素の実体について探求し、その理解を得ることで、膜タンパク質の新たな翻訳後機能調節機構にアプローチするものである。
本年度は、主にGlpGによるFliOの切断現象に焦点を当てて研究を行い、以下の研究成果を得た。(1)in vivo光架橋法によるGlpGとFliOの相互作用解析：UV反応性非天然アミノ酸アナログpBPA導入変異体を用いた部位特異的in vivo光架橋実験によりGlpG-FliO間の架橋を試みた。既知のGlpG-基質ペプチド共結晶構造をベースとしてGlpG及びFliOの相互作用残基を予測した。これを基にpBPA導入変異体を作製し、光架橋解析を行ったところ、GlpGのいくつかの変異体において複数の架橋産物を得た。予備的な架橋産物の精製を通して、FliOとの架橋が含まれることを示唆する結果を得た。(2)膜内切断プロテアーゼにおけるin vitro切断アッセイ系の構築：GlpGによるFliO切断のin vitro切断kinetics解析系の構築を視野に入れ、GlpG同様、膜内切断プロテアーゼに分類されるRsePのin vitro切断アッセイ系の構築を試みた。モデル基質の膜貫通配列をベースとしたFRET蛍光ペプチドをデザイン・合成し、精製したRsePタンパク質と混合し、蛍光プレートリーダーでリアルタイム蛍光測定を行ったところ、RseP依存的な蛍光シグナルの上昇を捉えた。この蛍光ペプチドデザインはkinetics解析に有用であることが期待される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は申請書の研究実施計画の項目【1】～【5】から構成される。本年度は項目【1】：「様々な架橋法を用いたGlpG―基質間の相互作用解析」及び項目【2】：「in vitro再構成系でのGlpGによるFliO切断の反応速度論的解析」を中心に研究を進め、【研究実績の概要】に示した(1)、(2)の成果を得た。(1)のGlpGとFliOのin vivo光架橋解析により、GlpG-FliO間の架橋と推測される架橋産物を得た成果は、項目【1】のGlpG-基質間相互作用解析の基盤となる重要なものである。また、GlpGとの架橋産物として架橋相手が未同定のものも複数得ており、未知の切断基質や機能調節因子等である可能性が示唆される。架橋相手の同定等を通じてGlpGによる基質切断の分子機構の解明につながることが期待される。また、(2)の膜内切断プロテアーゼRsePのin vitroリアルタイム切断アッセイ系を構築した成果は、項目【2】のGlpGによる基質切断kinetics解析系の実現に向けた土台となる成果である。FRET蛍光ペプチドのデザインや蛍光分光学的解析の方法論等、流用できる点が多く、項目【2】の達成に向けて大いに前進させるものであろう。また、RsePのin vitro切断kineticsアッセイ系自体、世界でも報告例はなく、この成果を基にした酵素学的解析は学術的価値を生み出すものと期待される。以上の観点から、ここまでの研究計画はおおむね順調に進展していると判断する。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度以降は引き続きGlpGによるFliOの「切断」を中心として以下の研究を行う。特にGlpGの新奇生理的切断基質としてのFliOの基質認識・切断機構及びその生理的意義の解明を主題とした学術雑誌への論文投稿を見据え、研究成果を取りまとめる方向で研究を進める。項目【1】：「様々な架橋法を用いたGlpG―基質間の相互作用解析」に関しては、引き続きin vivo光架橋実験によるGlpG-FliO間相互作用解析を進め、残基レベルでの相互作用様式の解明、基質認識モチーフや結合領域（exosite）の変異体を用いた解析、未知の架橋産物の質量分析法による架橋相手の同定と解析を行う。また、システイン導入変異体によるS-S架橋解析や、共免疫沈降解析等、補完的な相互作用解析も行う。項目【2】：「in vitro再構成系でのGlpGによるFliO切断の反応速度論的解析」に関しては、RsePによるFRET蛍光ペプチドを用いたin vitro切断アッセイ系をベースとし、FliO基質をミミックしたFRET蛍光ペプチドのデザインと合成、またGlpGの精製系の構築と改良を進め、GlpGのin vitro切断kinetics解析系の構築を本格化させる。また、RsePの切断アッセイ系に関してもMichaelis-Mentenパラメータの算出等によるkinetics解析法を確立し、RsePの基質認識・結合部位等の変異体を用いた膜内切断プロテアーゼの酵素学的特性の解析等を進める。
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| Causes of Carryover |
今年度の使用状況：（物品費）設備備品及び消耗品等は申請者がこれまで行ってきた大腸菌膜内切断プロテアーゼ関連の解析等を発展させたものであり、研究室の保有機器及び保有試薬、研究所の共同利用機器を使用することで研究遂行が可能であった。（旅費）国内学会の参加費用を本科研費とは独立の研究費から計上したこと、共同研究の打ち合わせが必要なかったこと等から使用額が減少した。（人件費・謝金等）既存の蛍光ペプチドを使用したため、新規の蛍光ペプチド合成委託費が発生しなかったことから使用額が減少した。（その他）機器修理等が発生しなかったことによって使用額が減少した。
次年度の使用計画：（物品費）研究の進捗状況により、光架橋法やin vitro切断アッセイ系の構築に必要となる脂質や蛍光試薬、架橋試薬等の購入費、免疫沈降実験に用いる抗体購入費等で使用する予定である。（旅費）次年度は積極的に学会に参加し、発表する予定である。（人件費・謝金等）次年度は研究成果をとりまとめ論文作成に取り掛かる予定である。その際には英文校閲費等を計上する。（その他）論文投稿料を計上する予定である。
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