2020 Fiscal Year Research-status Report
Effects on p53 diffusion along dsDNA and nonspecific binding constant between p53 and dsDNA of hyper-mobile water control
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19K06576
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
鈴木 誠 東北大学, 多元物質科学研究所, 名誉教授 (60282109)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鎌形 清人 東北大学, 多元物質科学研究所, 准教授 (90432492)
最上 譲二 東北大学, 工学研究科, 助教 (70713022)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ハイパーモバイル水 / DNA結合タンパク質 / １次元拡散係数 / p53 / タンパク質溶媒間相互作用 / 誘電緩和分光 / ラマン分光 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
がん抑制タンパクp53が2重らせんDNA（dsDNA）の標的配列を探す際、dsDNA上の拡散移動速度が重要である。初年度は、仔牛の胸腺dsDNA鎖の数mg/ml濃度水溶液を高分解誘電分光測定し、DNA鎖周りにハイパーモバイル（hyper-mobile）水層の存在と、Mg/Caイオン添加による水和層の変化が観測された。本研究ではλDNA上のp53の１次元拡散係数の２価金属イオン濃度依存性と水環境との関りを知るため、R2年度はλDNA鎖の水和特性測定を行った。総量 10 mgのλDNAを対象として水和特性測定を行うために測定法を水分子のOH伸縮振動のラマン分光に切り替えて、通常装置の数十～百倍の分解能（0.01%）の測定系を年度内についに実現して測定を行った。それにより、dsDNA周りの水はOH伸縮のbimodalスペクトルの高波数側ピーク（uncoupled mode, 3410 cm-1）の増加と低波数側ピーク（Fermi resonance coupled mode, 3250 cm-1）の減少が観測された。Mg/Caイオンを添加するとcoupled modeの波数域が参照緩衝液より低波数側にシフトして増加する傾向がみられ、dsDNAの近傍ではバルク中より大きな水分子クラスターの形成を示唆する。次年度はより明確にする実験を進める。
理論面では、dsDNA近くの蛋白質の位置変化による自由エネルギー変化と水の効果を調べるため多数（数万個）の水分子を含めた全原子計算を行い、既存の信頼性の高いエネルギー表示型(ER)計算法で調べてきた。常温の熱エネルギーkTの精度の計算はこれまで困難とされてきたがシンプルなイオン対についてはその精度計算が可能となった。溶質を蛋白質やdsDNAにすると目標精度の実現に課題が残っている。令和３年度は実験と計算ともに課題究明に向けて引き続き進める。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
λDNA上のp53の1次元拡散係数測定結果(Kamagata ら, 2015)と水和状態の関係を調べるため、R２年度にはλDNAを測定対象として限られた予算内で使用できるDNA濃度溶液で試みた。しかし初年度に高めた測定分解能でもSN比が不十分であった。対策として、ハイパーモバイル水の情報に対応するOH-stretch bandラマン分光法（Suzukiら, 2014）を採用して測定することとした。通常の分光器の分解能は~1%程度であるが、使用できるλDNA濃度がサブ mg/mlの場合、水溶液内の溶質（DNA）と同体積程度の水和層の特性を調べるためには分解能0.01%を実現する必要がある。CCDアレイ分光器の感度の温度依存性がクリティカルノイズ源となるため、その対策を取り続けて年度末に目標分解能0.01%を遂に実現できた。その結果、dsDNAの水和特性はOH-stretch bandの低波数域のFermi共鳴成分（coupled mode）強度がバルク水より低く、高波数域のuncoupled modeがバルク水より高いことが観測され、バルク水より動きやすい水和層の存在を示す結果を得た。引き続き３年度ではMgイオンとCaイオン添加の効果を調べる予定である。
計算面では、R2年度はタンパク質の水和自由エネルギーのdsDNAが作る高電場による摂動量を調べるために、エネルギー表示（ER）法に基づく水和自由エネルギー計算精度の確認を進めてきた。DNA鎖上のタンパク質の拡散移動への効果を見るには常温におけるkT程度の精度計算が必要となるが、溶媒と溶質を構成する多数の原子間の相互作用エネルギーに比べて熱エネルギーは1 ppm 以下のため困難であるが、水分子数万個中に入れたイオン対溶質の計算でその精度を達成できた。R3年度は、溶質をペプチドにして対策を検討しつつ計算を進める。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．高精度ラマンスペクトル測定：λDNA周りの水の性質を見るためにR2年度末に構築した高分解ラマン分光測定法（波数域1000~3766 cm-1）を用いてλDNA水溶液の測定を行う。 溶液温度20.0±0.02℃、濃度サブ mg/mlのDNA溶液とbufferを対象として、それぞれのスペクトルの連続測定を行い、各生スペクトルの水とDNAに起因しない４波数点ベースラインを使用して補正し、OH-stretch band areaで規格化したスペクトルを得た後に、それぞれの液のスペクトルの波数域ごとの積分値の時系列データを得て、データの集中部分から各波数域で同時に2σ以上外れたスペクトルを除いて各平均スペクトルを得る。そして試料液の直前直後のbuffer スペクトルとの平均差スペクトルを得る。上記測定法で2重鎖(ds)DNAの塩基濃度（~1 mM）以下とそれ以上の濃度のMg2+あるいはCa2+イオン添加による水和特性への効果を調べる。
２．λDNAとp53のC末ドメインの解離定数評価：蛍光色素を修飾したλDNAの回転拡散がp53結合によって遅くなる現象を利用し、p53の滴定による蛍光異方性の変化から解離定数測定を進め、KCl濃度、２価金属イオン（Ca2+, Mg2+）濃度依存性を調べる。
３．結合自由エネルギーに及ぼす電場効果計算：水中DNAの全原子MD計算とER法自由エネルギー計算の精度を高める方策としてER計算における参照系のサンプリング数の増加とNPT平衡化後のNVT計算を併用して調べる。
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| Causes of Carryover |
λDNAの水和特性を誘電緩和分光で測定するための必要DNA量を購入することが２年度の予算内ではできないためR2年度では初年度の予算から15万移してλDNA 10 mg（約23万円）購入して誘電分光測定溶液8 mLとした。DNA濃度が測定に適した濃度の1/10であるため前年度精度を高めた方法で測定してはみたが、信頼できる結果は得られなかった。この測定法でλDNAを再購入して誘電分光測定を繰り返しても信頼できる測定が難しいため、誘電分光法からラマン分光法に切り替えて水和測定を行うこととした。R2年度ではラマン分光スペクトル測定の分解能向上に傾注し、手に入る量のDNA試料液に対して目標精度を実現する水和測定法を年度末までに遂に構築することができた。そのためDNAを購入可能な量で目標の実験を進めることができるようになったため、R3年度にR2年度に予定した水和測定を含めて目標の実験を行うこととした。実験計画が変わったことでR2年度の残額約17万円を３年度に移すこととした。２名の分担者は配分額内で研究を進めているが、最終R3年度のそれぞれの研究に必要な生化学実験用消耗品と計算機用ハードディスクと解析用ソフトウェア用の額を用意するためにそれぞれ約7万円、約14万円を次年度に回すこととした。以上の理由で約38万円を次年度に使用します。
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Research Products
(4 results)
