2019 Fiscal Year Research-status Report
区画化による分子共生はRNAワールドを飛躍させるか？
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19K06579
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| Research Institution | University of Toyama |
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Principal Investigator |
松村 茂祥 富山大学, 学術研究部理学系, 講師 (40619855)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | RNAワールド / 実験進化 / リボザイム / 区画化 / マイクロ流体システム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
生命の起源において、RNAはいかに進化しえたのだろうか？ どのようにして、進化の原動力である分子の多様性が自発的に出現・蓄積し、またそこからどのようにRNAが高機能化しえたのかは、非常に重要かつ未解決の問題である。本研究では、マイクロ流路デバイスにより微小液滴を操作する技術（液滴マイクロ流体システム）を用いてRNA酵素（リボザイム）の実験進化を行い、この問題に切り込んでいる。
本年度は、リボザイムに人為的に変異を導入し、液滴を用いた実験進化を行うことで、リボザイムの高性能化を目指した。まず、変異誘発PCRを用いて、RNA切断リボザイムであるVSリボザイムの遺伝子に変異を導入し、ランダム化ライブラリーを作製した。次いで、マイクロ流体システムによりそれら遺伝子を一つずつ微小液滴に封入し、液滴内でのリボザイム活性の評価・選別を行った。この過程を5ラウンド行った結果、活性の濃縮が確認されたため、プールから40種のクローンを単離し、配列を解析した。その中にはもとの野生型の配列は見られず、実験進化の成功が示唆されたため、数種類を選び、リボザイムの活性測定を行った。そのうち1種は、野生型のリボザイムを超える活性を示した。このことは、液滴を用いた本手法が想定通りに機能し、リボザイム活性の実験的進化に有効であることを示している。現在、得られたプールを次世代シーケンサーで解析するとともに、リボザイムのさらなる機能向上を目指して、より厳しい条件で追加の進化実験を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本年度は、リボザイムに人為的に変異を導入し、液滴を用いた実験進化を行うことで、リボザイムの高性能化を目指した。まず、変異誘発PCRを用いて、RNA切断リボザイムであるVSリボザイムの遺伝子に変異を導入し、ランダム化ライブラリーを作製した。次いで、マイクロ流体システムによりそれら遺伝子を一つずつ微小液滴に封入し、液滴内でのリボザイム活性の評価・選別を行った。この過程を5ラウンド行った結果、活性の濃縮が確認されたため、プールから40種のクローンを単離し、配列を解析した。その中にはもとの野生型の配列は見られず、実験進化の成功が示唆されたため、数種類を選び、リボザイムの活性測定を行った。そのうち1種は、野生型のリボザイムを超える活性を示した。
このことは、液滴を用いた本手法が想定通りに機能し、リボザイム活性の実験的進化に有効であることを示している。本年度は、本計画の初年度であるにもかかわらず、実験手法を開発し、かつそれを運用して、実際の実験進化を行うことができた。本手法は、先端技術である液滴マイクロ流体システムを用いるため極めて難度の高いものであり、これを実際に運用し、もとの野生型を超える活性のリボザイムを得られたことから、現時点で本研究は極めて順調に進展していると評価できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
まず、得られたプールを次世代シーケンサーで解析し、実験進化の過程でのRNA分子種の変化を調査する。この実験により、RNAの多様性がどのように変化しているのかがわかると考えられる。また、リボザイムのさらなる機能向上を目指して、より厳しい選択圧条件で追加の進化実験を行う。この実験を行うためには、新たなマイクロ流体デバイスの開発が必要なので、それも並行して進める。さらに、異なる活性をもつ複数種のリボザイムを同時に進化させるため、実験系のブラッシュアップを進める。具体的には、反応溶液の組成の最適化、およびマイクロ流体システム装置の光学系の改良を行う。
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| Causes of Carryover |
本年度の研究計画に関わる経費として、他の予算等を優先的に充当したため、本経費に次年度使用額が生じるに至った。本年度は研究が順調に進行したため、次年度はこれをさらに軌道に乗せ、さらにそこから派生するいくつかの別の実験にも取り組む予定である。次年度使用額は、次年度の配分額と合わせ、それら実験の拡充に使用する計画である。
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