2020 Fiscal Year Research-status Report
介在神経が前駆細胞から移動能を有した成熟細胞へと分化する機序の解明
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19K06909
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| Research Institution | Wakayama Medical University |
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Principal Investigator |
片山 圭一 和歌山県立医科大学, 医学部, 講師 (20391914)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 介在神経 / Rhoファミリー低分子量Gタンパク質 / 神経細胞移動 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Rhoファミリー低分子量Gタンパク質（RhoA, Cdc42, Rac1）を、介在神経の発生母地である内側基底核原基の脳室帯の前駆細胞から欠損させると介在神経の移動が障害されるが、移動中の介在神経で欠損させても移動は障害されない。これは介在神経の前駆細胞が移動する能力を有した成熟介在神経へと分化するのに必須のイベントが内側基底核原基の脳室帯に存在し、そのイベントにはRhoファミリー低分子量Gタンパク質が必須であることを示している。本研究はその分子メカニズムを解明することを目的としている。令和元年度には、Rac1とCdc42のノックアウトマウスを用いて、内側基底核原基の脳室帯のRNA発現解析を行い、Rac1とCdc42の下流で介在神経の移動能獲得に寄与する可能性の高い遺伝子として、それぞれMid1とRgccを同定していた。今年度は、ゲノム編集技術を用いてこれら遺伝子のノックアウトマウスを作製した。ゲノム編集で作製した遺伝子改変マウスは、ガイドRNAが標的とする配列以外のゲノム領域に、意図しない変異が導入される問題（オフターゲット効果）の影響を減らすために野生型のマウスと何世代か交配を行う必要がある。本研究では、第6世代まで交配させてから本格的な解析を開始することとして、交配を進めている。交配が終了次第、ノックアウトマウスの表現型を解析してMid1およびRgccの遺伝子機能を明らかにする。本実験により、介在神経の前駆細胞が移動する能力を有した成熟介在神経へと分化する機構を解明することができるものと期待される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
現在までにRac1とCdc42のノックアウトマウスの内側基底核原基の脳室帯から抽出したRNAを用いてRNA-Seq解析を行い、どちらのノックアウトマウスでも成熟した介在神経に発現する遺伝子の発現が増加していることを明らかにした。この結果は、遺伝子発現の観点からは前駆細胞から成熟介在神経への分化が亢進していることを示しており、一見すると介在神経がほとんど移動することができないという表現型とは矛盾する結果であるが、介在神経の前駆細胞が移動する能力を有した成熟介在神経へと分化する機構を解明する上で重要な知見であると考えている。さらに、Rac1とCdc42のノックアウトマウスの内側基底核原基の脳室帯で特異的に発現が減少する遺伝子として、それぞれMid1とRgccを発見し、ゲノム編集技術を用いてこれら遺伝子のノックアウトマウスを作製した。これらマウスは現在ガイドRNAのオフターゲット効果の影響を減らすために野生型のマウスと交配を行っている。母マウスが育児放棄をするなどして、予定通り交配が進まない時期もあったが、これまでにMid1ノックアウトマウスは第4世代まで、Rgccノックアウトマウスは第5世代までそれぞれ交配を終了しており、この後、第6世代まで交配させてから本格的な解析を開始する予定である。マウスの表現型を解析して遺伝子の機能を検索することで、介在神経の前駆細胞が移動する能力を有した成熟介在神経へと分化する機構を解明することができるものと期待される。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度はMid1とRgccのノックアウトマウスを野生型マウスと第6世代まで交配を行い、これらマウスを用いて介在神経の移動に関する解析を行う。これまでに行った予備解析では、Rgccは神経上皮の頂端部での接着結合や頂底極性の形成に関与する可能性を示唆する結果を得ている。これらの減少はCdc42ノックアウトマウスにもみられた表現型ではあるが、さらなる解析を行い、RgccやMid1が介在神経の前駆細胞が移動する能力を有した成熟神経細胞へ分化する過程にどのように関与しているかを明らかにする。
また、RhoAのノックアウトマウスはRac1やCdc42のノックアウトマウスと比べると表現型が軽かったため、これまで解析を行ってこなかったが、Rac1とCdc42のノックアウトマウスで発現に変化がみられた遺伝子について定量的PCRを用いた発現解析を行い、Rac1, Cdc42およびRhoAのノックアウトマウスに共通してみられる現象とそれぞれのマウスに特異的にみられる現象を明らかにし、各々の遺伝子発現の変化がもつ意味について考察を行う。
さらに、移動中の介在神経について、その形態（成長円錐・突起の長さ・分岐の数等）に関する詳細な解析を行う。また、細胞骨格関連タンパク質（F-actin, Cortactin, Ac-Tubulin, Tyr-Tubulin, Tau1等）の細胞内局在についても解析を行い、脳室帯からRhoファミリー低分子量Gタンパク質を欠損した介在神経に、正常な介在神経と比べてどのような違いがあるのかを解析する。これらの解析により、脳室帯からRhoファミリー低分子量Gタンパク質を欠損することで、介在神経にどのような変化が生じているのかを明らかにし、前駆細胞が移動する能力を有した介在神経へ分化する過程を理解する手がかりにしたいと考えている。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額が生じた理由は新型コロナウィルスの感染拡大により、参加予定であった学会が中止になったり、オンライン開催になったりして、旅費を使用する必要がなくなったからである。
研究資金は研究計画の遂行および成果発表に使用させて頂く予定である。
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