2020 Fiscal Year Research-status Report
翻訳終結因子eRF3のプロセシング異常がもたらす新しい癌発症メカニズム
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19K07086
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
細田 直 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(薬学), 准教授 (40438198)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 翻訳終結 / mRNA分解 / トリプレットリピート / アポトーシス / 癌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒト翻訳終結因子eRF3のN末端には、GGCトリプレットリピートによってコードされるグリシンリッチ領域が存在する。先に申請者らは、この領域がプロテアーゼにより切断されることを見出した。切断により露出したN末端配列にはアポトーシス阻害因子IAPが結合し、アポトーシスが制御されることを明らかにした。興味深いことに、正常ではこのリピート数が10もしくは11であるのに対し、12以上になると乳癌および胃癌発症率が増大することが、遺伝子多型解析により示されている。本研究では、eRF3のもつグリシンリッチ領域のプロセシング異常が癌発症を増大させる分子メカニズムを解明する。
本年度はトリプレットリピートが0～20となる複数のeRF3哺乳動物発現ベクターの作製を完了した。昨年度までの解析において、eRF3はmRNA分解における律速段階となるポリA鎖分解の速度を適切に保つ機能を担うことを示してきているが、リピート12のeRF3発現によりこの機能を減弱する傾向は認められるものの、有意な差は得られなかった。eRF3は、C末端領域において終止コドンを直接認識するeRF1と結合することで翻訳終結に機能する一方、N末端領域はポリA鎖結合蛋白質PABPと結合することで翻訳と共役したmRNAのポリA鎖短縮化および分解に関与する。リピート数の違いがPABPおよびeRF1との結合能にもたらす効果を検証したものの、有意な差異は認められなかった。eRF3発現系および解析を行う培養細胞株の再考が必要と考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度、トリプレットリピートが0～20となるeRF3発現ベクターの作製を完了し、これらがmRNA分解制御、およびeRF1、PABPとの結合に及ぼす効果について検証したものの、有意な差異が認められなかった。よって（３）やや遅れている、とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度までの解析により、一過的過剰発現系においてはeRF3リピートの増幅が及ぼす効果が観察できなかった。そこで、持続的にeRF3を発現させたときの、リピートの増幅が及ぼす効果について検証する。CRSPR-Cas9系をもちい、各種リピート数をもつeRF3を安定的に発現する細胞株を作製し、eRF3リピート増幅がプロテアーゼによる切断、翻訳、mRNA分解に及ぼす影響について以下解析を進める。
（１）eRF3は、小胞体ストレス（ツニカマイシン、タプシガルギン）環境下において顕著な切断をうける。この条件下においてトリプレットリピートが0～20となるeRF3の切断について、リピート増幅にともない抑制されるかどうか解析する。
（２）eRF3は翻訳終結およびmRNAポリA鎖短縮化および分解促進に関与する。リピート数がこれらに影響を及ぼす可能性について検証する。翻訳効率については、ルシフェラーゼレポータ遺伝子を用いた解析に加え、リボソームプロファイリング法による解析を行う。mRNAポリA鎖短縮化および分解についてはbグロビンレポータ遺伝子を用い解析する。
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| Causes of Carryover |
新型コロナ感染症対策により、実施担当大学院生に対し大学構内への入校規制が行われ、予定していた実験を行うことができなかったため。本年度の残余額は、次年度においてこれら未実施となった実験に充当する。
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