2019 Fiscal Year Research-status Report
Functional elucidation of human blood-brain barrier using iPS-derived brain microvascular entdothelial cells
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19K07231
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| Research Institution | Teikyo University |
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Principal Investigator |
出口 芳春 帝京大学, 薬学部, 教授 (40254255)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
手賀 悠真 帝京大学, 薬学部, 助教 (50809043)
黒澤 俊樹 帝京大学, 薬学部, 助手 (90839466)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 血液脳関門 / ヒトiPS細胞由来脳毛細血管内皮細胞 / トランスポーター / 輸送性レセプター / ヒト不死化脳毛細血管内皮細胞 / 定量的PCR |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的はヒトiPS細胞由来脳毛細血管内細胞(hiPS-BMECs）がヒト血液脳関門(BBB)の機能を解明するモデル細胞になることを検証することであった。そのために、2019年度は 1)内因性物質および薬物輸送に関わるトランスポーター群および輸送性レセプター群の遺伝子発現を定量的PCR法で測定した。また、2)発現の高かったトランスポーターについて、免疫染色の手法を用いて局在を調べた。結果は以下の通りである。
1)hiPS-BMECsにおいて、多くのABCおよびSLCトランスポーター、輸送性トランスポーターの遺伝子発現を確認した。ABCトランスポーター群については、ABCC1(MRP1)、ABCC5(MRP5)、ABCG2(BCRP)が、対象として用いたヒト不死化細胞hCMEC/D3細胞における発現に比べ相対的に高値を示した。SLCトランスポーター群に関しては、SLC2A1(GLUT1)、SLC2A3(GLUT3)、SLC1A3(GLAST)、SLC7A5/SLC3A2(LAT1/4F2hc)、SLC16A1(MCT1)に加え、SLCO2A1(OATP2A1)、SLC35F2、SLC44A2(CTL2)の発現が高いことが特徴的であった。また、輸送性レセプターに関しては、LRP1の発現が高かった。発現量の高かったBCRPに関して、免疫学的染色を行い共焦点レーザー顕微鏡で局在を調べた結果、主に血液側細胞膜に発現することがわかった。今回の結果は、単離ヒト脳毛細血管内皮細胞での報告値に対応していることから、ヒトの脳に必要な栄養物質の供給、あるいは脳内の老廃物や毒物の排除に必要なトランスポーターがhiPS-BMECsに保持されていることが明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の実施計画の80％が完了し、期待通りの成果を収めることができた。本年度はトランスポーター遺伝子の発現を中心に検討したが、研究計画書では網羅的半定量的質量分析法(SWATH法)を用いてタンパク質レベルでの発現動態を検討する予定であった。これについては、次年度以降に研究協力者の大槻純男先生と検討を進める。
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| Strategy for Future Research Activity |
2020年度は以下の研究を推進する。
1)2019年度の結果からhiPS-BMECsにABCB1(P-gp)の発現が少ないことがわかった。この原因は不明であるが、未分化iPSからの分化・誘導過程で化学的または遺伝子改変操作を行うことによりABCB1過剰発現系を作製する。この検討から、排出機能の解析およびBCRPとの相互関連について検討を加える。
2)トランスウェル上に培養したhiPS-BMECsを用いて、ヒトBBBの脳からの排出機能を明らかにする。これまでに、ヒト脳からの排出機能をin vitroで検出する簡便かつ実用的な方法がなかった。hiPS-BMECsはtight junction形成能と極性の高い細胞である。この細胞を用いることにより、上記の問題点が克服できる可能性があり、いくつかのモデル薬物を用いて、脳からの排出動態を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
今年度の研究計画において、hiPS-BMECsおけるトランスポータータンパク分子の発現を網羅的半定量的質量分析法(SWATH法)で解析することを考えていたが、hiPS-BMECsの培養法の確立および遺伝子解析、免疫染色に時間がかかったため、SWATH法での解析は次年度以降に回すことにし、差額を次年度使用とした。
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