Analyses of functional differentiation and interaction of RAMP1,2 and 3 applying the maternal Cas9-based multiple genome editing

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K07477
• Research Institution: Shinshu University
• Principal Investigator: 桜井 敬之 信州大学, 学術研究院医学系, 准教授 (80317825)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 武井 則雄 北海道大学, 医学研究院, 助教 (50523461) ; 新藤 隆行 信州大学, 学術研究院医学系, 教授 (90345215)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: アドレノメデュリン / 受容体活性調節タンパク質 / RAMP / ゲノム編集 / CRISPR/Cas9 / 多遺伝子同時改変 / 炎症性腸疾患 / 腸オルガノイド

Outline of Annual Research Achievements

アドレノメデュリン(AM)は、多彩な生理作用を有する生理活性ペプチドであり、各種疾患への臨床応用が期待されている。この多生理作用は、AMの受容体に結合する受容体活性調節タンパク質のRAMP1、2、3によって制御されていると考えられているが、詳細な分子機構は不明である。 本研究では、複数同時ゲノム編集という申請者が独自開発した技術によりRAMP1、2、3について複数の変異を併せ持つマウス群を体系的に作製する。同マウス群による炎症性腸疾患などの病態モデルの解析、腸オルガノイドや、 各種の初代培養細胞を用いた検討によりRAMP1、2、3の病態生理学的意義の解明し、AMの臨床応用への知識基盤の構築に貢献することを目標とする。
本年度は、昨年度に樹立した RAMP1、2、3遺伝子を体系的に同時ゲノム編集したマウス群の繁殖を進め実験用のマウス個体を先ず確保した。これら体系的同時 RAMP遺伝子群変異マウス群を用いて、(1) デキストラン硫酸ナトリウムによる腸炎症モデルでの病態差の解析、(2) 腹腔マクロファージの取得・培養によるLPSやサイトカインでの炎症刺激における応答性の解析および、(3) RAMP遺伝子群変異腸オルガノイドの作成とその各種炎症刺激における応答性の解析を行った。
その結果、RAMP1、2、3遺伝子群の欠損形態と腸炎症病態の重症度の相関から、マウスによる腸炎症病態にはRAMP1、3が主に関わること、そして腸炎症病態の解析からRAMPを発現するマクロファージなどの免疫系細胞から腸組織への作用の重要性を示唆するデータを得た。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

体系的同時 RAMP群ゲノム編集マウスを用いて、本年度の解析目標である (1) デキストラン硫酸ナトリウムによる腸炎症マウスモデル解析、(2) 腹腔マクロファージの取得・培養による炎症刺激における応答性差の解析および (3) RAMP遺伝子変異腸オルガノイドの作成と各炎症刺激における応答性の解析を実施した。

Strategy for Future Research Activity

最終年度は、
(1) RAMP1、2、3同時遺伝子改変マウスを用いて個体レベルでの炎症腸炎病態解析を続ける。実験用の体系的同時 RAMP群ゲノム編集マウスの繁殖は順調である。かつ我々独自の同時遺伝子改変マウス作製は迅速かつ高効率であるので、もしも必要が生じれば、新規遺伝子改変マウスを追加作製し解析に供する。
(2) 同RAMP遺伝子群改変マウス群由来の腸上皮細胞、線維芽細胞、免疫系細胞各々におけるAMや炎症サイトカイン刺激に対する応答性や細胞内シグナル伝達様を検討することで、RAMP1、2、3間の機能分化と相互作用の包括的な理解を得る。
(3) そして初年度から取得した全データをまとめ、総括する。

Research Products

• [Journal Article] Adrenomedullin-RAMP2 system ameliorates subretinal fibrosis by suppressing epithelial-mesenchymal transition in age-related macular degeneration (2021)
  • Author(s): Tanaka, M.; Kakihara, S.; Hirabayashi, K.; Imai, A.; Toriyama, Y.; Iesato, Y.; Sakurai, T.; Kamiyoshi, A.; Ichikawa-Shindo, Y.; Kawate, H.; Tanaka, M.; Cui, N.; Wei, Y.; Zhao, Y.; Aruga, K.; Yamauchi, A.; Murata, T.; Shindo, T.
  • Journal Title: Am J Pathol. Volume: 191 Pages: 652-668
  • DOI: 10.1016/j.ajpath.2020.12.012
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Deficiency of the adrenomedullin-RAMP3 system suppresses metastasis through the modification of cancer-associated fibroblasts. (2020)
  • Author(s): Dai, K.; Tanaka, M.; Kamiyoshi, A.; Sakurai, T.; Ichikawa-Shindo, Y.; Kawate, H.; Cui, N.; Wei, Y.; Tanaka, M.; Kakihara, S.; Matsui, S.; Shindo, T.
  • Journal Title: Oncogene Volume: 39 Pages: 1914-1930
  • DOI: 10.1038/s41388-019-1112-z
  • Peer Reviewed
• [Presentation] アドレノメデュリン-RAMP3系欠損は、癌関連線維芽細胞のポドプラニン発現を抑制し、臓器間転移を抑制する (2020)
  • Author(s): 戴昆, 田中愛, 神吉昭子, 桜井敬之, 新藤優佳, 河手久香, 崔南奇, 田中正明, Wei Yangxuan, 柿原伸次, 中村啓成, 新藤隆行
  • Organizer: 第49回日本心脈管作動物質学会
• [Presentation] アドレノメデュリン-RAMP2, 3系は、心血管系ストレスに対して、心臓の恒常性を制御する (2020)
  • Author(s): 崔南奇, 神吉昭子, 桜井敬之, 新藤優佳, 河手久香, 田中愛, 戴昆, 田中正明, Wei Yangxuan, 柿原伸次, 中村啓成, 新藤隆行
  • Organizer: 第49回日本心脈管作動物質学会
• [Presentation] 加齢黄斑変性における、ケモカイン受容体CXCR4の網膜下線維化作用 (2020)
  • Author(s): 田中正明, 柿原伸次, 平林一貴, 今井章, 鳥山佑一, 家里康弘, 田中愛, 河手久香, 神吉昭子, 新藤優佳, 桜井敬之, 村田敏規, 新藤隆行
  • Organizer: 第124回日本眼科学会
• [Presentation] 急性腎障害におけるアドレノメデュリン2の病態生理学的意義 (2020)
  • Author(s): 神吉昭子, 桜井敬之, 新藤優佳, 河手久香, 田中愛, 戴昆, 崔南奇, Yangxuan Wei, 田中正明, 柿原伸次, 松井周平, 中村啓成, 新藤隆行
  • Organizer: 第93回日本内分泌学会
• [Presentation] Adrenomedullin-RAMP2 and RAMP3 systems regulate cardiac homeostasis against cardiovascular stresses (2020)
  • Author(s): Nanqi Cui, Takayuki Sakurai, Akiko Kamiyoshi, Yuka Shindo, Hisaka Kawate, Megumu Tanaka, Kun Dai, Yangxuan Wei, Masaaki Tanaka, Shinji Kakihara, Shuhei Matsui, Takayuki Shindo
  • Organizer: 第84回日本循環器学会