2020 Fiscal Year Research-status Report
自然免疫受容体に対するアゴニスト抗体のワクチンアジュバントへの応用
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19K07491
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| Research Institution | Aichi Medical University |
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Principal Investigator |
山崎 達也 愛知医科大学, 医学部, 講師 (50624087)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 抗体遺伝子 / DNA免疫 / インフルエンザウイルス / RP105(CD180) / ワクチン / アジュバント / 感染症 / 自然免疫 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、DNA免疫法の新しいアジュバントとして、自然免疫受容体の１つ、Radioprotective 105(RP105)に対するアゴニスト抗体（RP14）を応用することを目的に研究をすすめている。RP14は、強力にB細胞を活性化することが報告されている。また我々は、RP14をタンパク抗体ではなく、RP14を発現する「抗体遺伝子」を生体内に投与し、生体内の細胞にRP14を発現させて、その効果を評価している。なぜなら抗体遺伝子は、抗体医薬の低コスト化を期待でき、さらに目的に応じて改変した抗体を精製する必要なくその効果を評価できるからである。
前年度では、膜貫通ドメイン遺伝子を付加したRP14抗体遺伝子（膜型RP14）を、ヒト胎児腎臓(Human Embryonic Kidney [HEK]） 293T細胞に発現させ、マウス脾臓細胞と共培養して、脾臓B細胞を活性化できることを明らかにした。
本年度では、実際に膜型RP14抗体遺伝子とインフルエンザウイルス抗原遺伝子をマウスにDNA免疫し、ウイルス抗原特異的抗体価が有意に上昇するか検討した。ウイルス抗原遺伝子は、インフルエンザウイルス膜タンパクの１つHAを用いた。その結果、DNA免疫して2週間後、血清中に有意なHA特異的IgGとHA特異的IgMレベルが検出された。このマウスに致死量のインフルエンザウイルスを鼻腔から肺に感染させたところ、有意に肺洗浄液中のウイルス価の減少、体重減少の抑制、生存率の上昇が認められた。
本年度の成果をまとめて、Frontiers in Immunology誌(Yamazaki T et al Front Immunol 2020)に発表した(Corresponding: Yamazaki T and Akashi-Takamura S, Lead contact: Yamazaki T) 。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
予定通り、RP14抗体遺伝子（膜型RP14）の、DNA免疫におけるアジュバント効果の評価をおこなうことができた。さらに論文発表という成果もあげることもできた。抗体遺伝子を用いた受動免疫法の研究において、抗体を細胞膜上に発現させて効果を得た報告は他にはない。ゆえに本研究の成果は、新規性の高いDNA免疫法のアジュバント候補を示しただけではなく、抗体遺伝子のあたらしい応用法についても示せたと考えている。さらに高いアジュバント効果を目指すため、以下の２つの課題が明らかとなった。
1.組換えRP14抗体の抗原結合能の低下：本研究で用いたRP14はラット由来の抗体であるが、DNA免疫法の検討は過去の経験からマウスを用いた。ゆえにマウスに対する抗原性をできるだけ小さくするために、RP14産生ハイブリドーマからクローニングしたラット抗体遺伝子をマウス抗体遺伝子へ組み換えた。具体的には、可変領域遺伝子はオリジナルのラット抗体由来のままで、定常領域遺伝子のみマウスIgGとした(キメラRP14)。しかし、オリジナルのラットRP14と比べ、キメラRP14は抗原結合能が著しく低下していた。
2.マウス血中におけるRP14レベルは短期間で低下した：本研究では、ハイドロダイナミクス法（尾静脈注射）で遺伝子投与をおこなった。この方法では主に肝臓で遺伝子が発現することが知られている。RP14抗体遺伝子を投与したところ、投与後７日目で、血清中のRP14レベルはほとんど検出されなくなった。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度では、まず上記課題２つについて取り組むことにする。
1.RP14抗体遺伝子の最適化：抗体のH鎖をドメインで分けると、可変領域(Variable region)はVH、定常値領域(Constant region)はCH1, CH2, CH3に分けられる。参考文献から、CH1ドメインが抗体結合能に大きく寄与していることが知られている（Janda A et al Front Immunol 2016）。まずは、キメラRP14の定常領域のマウスCH1をラットCH1に変えて、抗原結合能が上昇するか検討をおこなう。
2.RP14抗体遺伝子投与法の最適化：DNA免疫法で最もよく使用される方法で、エレクトロポレーション法がある。この方法は筋肉に遺伝子を投与し、投与部位をパルスすることで細胞に遺伝子を導入する方法である。筋肉では遺伝子が長期間保持されるので、遺伝子の持続的な効果が期待できる。申請者の過去の成果で、少なくとも遺伝子投与後90日程度は、血清中の抗体は高いレベルが保持されていた(Yamazaki T et al Jpn J Infect Dis 2011)。次年度では、RP14抗体遺伝子をエレクトロポレーション法で投与し、RP14の持続的な発現が得られるか検討をおこなう。
1,2で得られた条件で、RP14をHA抗原とともにマウスへ投与し、HA特異的抗体レベルや、インフルエンザウイルス感染防御能を、ウイルス価、生存率、体重減少率の測定によって評価する。
検討した条件で、RP14抗体遺伝子のアジュバント効果の上昇が得られたら、申請書の計画のように、RP14の生体内における作用メカニズムを明らかにする。具体的には、RP14によるアジュバント効果の責任細胞（樹状細胞やT細胞の関与が重要か）について解析をおこなう。
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Research Products
(2 results)
