2019 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of the mechanisms for leukemogenesis in Friend-virus infected mice
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19K07581
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| Research Institution | Kindai University |
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Principal Investigator |
塚本 徹雄 近畿大学, 医学部, 助教 (80750223)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
宮澤 正顯 近畿大学, 医学部, 教授 (60167757)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | フレンドウイルス / 白血病 / 白血病幹細胞 / 造血 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
2019年度は研究計画に沿って、フレンドウイルス(FV)誘発赤白血病細胞を解析し、白血病幹細胞(LSC)と思われる細胞の特徴の把握を進めた。まずBALB/C、B6マウスの交配F1世代マウスにFVを感染させて10日後に脾腫を呈した状態で脾細胞を回収し、幹細胞因子(SCF)、骨形成因子4型(BMP4)、ソニック・ヘッジホッグ(Shh)添加培養液で7日間培養してLSC分画を増幅させフローサイトメトリーFACS解析したところ、LSCを含むKit陽性分画にT-cell immunoglobulin mucin-3 (TIM-3)、Galectin-9 (Gal-9)を高発現する細胞集団を検出した。このKit+TIM-3+Gal-9細胞は少数であるが、培養前のFV感染マウス脾細胞にも観察されたため、LSCを含む分画の表現型である可能性が示唆された。さらに、過去樹立された多数のFV白血病細胞株のうち4種類の表現型を調べたところ、驚くべきことにそのうち2種類は上記Kit+TIM-3+Gal-9+表現型を有することが分かった。このことからFV白血病細胞の発生・維持におけるTIM-3、Gal-9の役割の解明が今後重要であると考えられる。
さらに非感染B6マウス骨髄の造血前駆細胞の解析では、Gal-9がKit陽性CD71陽性細胞に高発現していた。Kit+CD71+細胞は赤血球コロニー形成細胞(CFU-E)であり、ウイルス標的細胞のひとつと考えられる。Gal-9を発現しないGal-9 KOマウスの解析においては、新生児マウスの肝臓、およびフェニルヒドラジン投与(急性貧血誘発)成体マウスの脾臓において、Kit+CD71+細胞の頻度が野生型B6マウスと比して有意に低下することを確認した。このことは、Gal-9発現の有無がストレスに対する造血反応になんらかの影響を与えていることを示唆する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究ではCD4変異B6マウス系統においてSf-Stkシグナル欠損下でLSCが生成され、赤白血病が発症する機序を解明する。とくに、赤血球前駆細胞とストレス赤芽球に元々発現するGal-9のFV誘発赤白血病発症への寄与を調べる。また、FV誘発赤白血病の脾臓にみられるKit+Sca-1+TIM-3+Gal-9+細胞が真にLSCであることを移入実験で示す。このように、赤血球前駆細胞の生理的機能と白血病細胞の維持増殖機能との関係に関する研究は全く独自であり、白血病研究の新たなページを開くものと考える。
本研究は上記の目的のもと実施されており、2019年度は研究計画調書に記載した2019-2020年度の計画に従って実施し、それに沿った実験結果が得られているため、ほぼ順調に進捗していると考えられる。まず、CD4変異マウス由来FV赤白血病細胞の表現型解析が順調に進捗した。そのため、過去のFV白血病細胞株の表現型解析にまで発展し、それらの一部が白血病幹細胞様表現型を有することまでつきとめることができた。このことについては、当初予期した以上の成果が得られていると評価できる。
一方、2020年度以降に計画しているFV感染実験のためのマウス作成であるが、こちらもおおむね順調である。そのため、Gal-9 KOマウスの解析がすでに可能となっており、Gal-9 KOマウスにおけるストレス後の造血反応解析が、一部前倒しで開始されている。このことも含め、3年間の研究実施計画について大きな見通しが得られている。
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| Strategy for Future Research Activity |
2020年度以降の研究内容は大きくin vitroでの白血病細胞解析と、マウスを用いた白血病関連因子解析に分けられる。このうちマウス実験は、非感染実験、FV感染実験、FV感染移植実験に分けられる。
In vitro実験においては、これまでに樹立されたFV白血病細胞株を用いてTIM-3/Gal-9の機能を解析する。アポトーシス誘導条件下にて、TIM-3、Gal-9発現量を操作したときのアポトーシス抵抗性への影響を調べる。
非感染マウス実験では、B6マウスから作成されたGal-9 KOマウスを用いてGal-9の造血に関わる機能をひきつづき解明する。データは野生型B6マウスと比較する。(1)Gal-9 KO成体マウスの解析では、血算(赤血球数・ヘマトクリット)、脾細胞・骨髄細胞の赤血球系コロニー形成能(前駆細胞活性)をしらべるほか、FACSによりGal-9発現細胞の特徴を明らかにする。また、フェニルヒドラジン投与や慢性炎症により惹起される貧血の動態を調べる。(2)Gal-9 KO胎児の解析では、妊娠後14-20日において解剖し、胎児肝臓白血球を解析する。
FV感染マウス実験では、B6マウス系統の高い免疫能が妨げとなることから、まず免疫能を低下させたCD4変異B6マウスとGal-9 KOマウスの交配によりCD4変異Gal-9KOマウスを作成する。CD4変異Gal-9KOマウスにFVを感染させ、白血病を生じるかどうか、経過を野生型Gal-9をもつCD4変異マウスと比較検討する。FV感染後異なる週数にて解剖し、脾腫、脾細胞FACS、コロニー形成能を評価するほか、白血病幹細胞の培養分離を試みる。
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