2019 Fiscal Year Research-status Report
Analysis of the HTLV-1 protein-mediated the regulation mechanism(s) of the host cells through the interaction with HIF-1 alpha
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19K07644
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
草野 秀一 鹿児島大学, 総合科学域総合研究学系, 准教授 (10350662)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | Hypoxia / HIF-1 / HTLV-1 / ゲノム編集 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
多くのヒト発がんウイルスは、低酸素誘導因子（HIF）-1αの転写・翻訳・分解を制御することで、細胞がん化関連遺伝子の発現を促進することが知られている。ヒトT細胞白血病ウイルス(HTLV)-1感染ATL細胞株においてもHIF-1αの細胞内発現量が亢進していることが報告されているが、HIF-1αが感染細胞のがん化やウイルスゲノム複製にどのような役割を演じているのか、未だに明らかになっていない。本研究では、HTLV-1タンパク質Taxが標的とする宿主因子であるHICとHTLV-1タンパク質HBZが、HIF-1αの機能にどのような影響を及ぼすのかを検討した。
動物培養細胞株及び大腸菌発現系を用いた解析から、HICはHIF-1αのみならず、HIF-1βとも直接相互作用した。そして、この相互作用はHIF-1αの機能発現に必須なHIF-1αとHIF-1βのヘテロ二量体形性を阻害し、HIF-1α依存的な低酸素誘導因子応答配列（HRE）からの転写を強力に抑制する事が明らかになった.
また、HBZもHICと同様にHIF-1α依存的なHREからの転写を強力に抑制した。しかしながら、動物培養細胞株を用いた解析でHBZはHIF-1αと相互作用したが、HICとは異なりHIF-1βとは相互作用せず、ヘテロ二量体の形成にも影響を及ぼさなかった。
さらに、HICのHTLV-1感染T細胞株における機能の解析をするために、遺伝子導入効率の低い細胞に於いてもCRISPR/Cas9ゲノム編集法が効率よく行えるように、終止コドンを融合した発光ペプチドタグであるHiBiTをノックインすることで標的遺伝子がノックアウトされた細胞をスクリーニングする手法を開発し、Tax発現HTLV-1感染T細胞株K3TのHIC発現をノックアウトすることに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
HICに関する解析が順調に進み、HICがどのような機構でHIF-1αの機能を抑制するのかを明らかにすることができた、まずは、HICとHIF-1に関する解析結果を論文としてまとめたいと考えている。
また、特異性の高い抗体が市販されていないHICを遺伝子導入効率が低い細胞株でノックアウトするのは困難であったが、終止コドンを融合した発光タグをノックインするという効率的なスクリーニング法を独自に開発し、HICノックアウトHTLV-1感染T細胞株を樹立することができ、令和2年度以降に行う研究の良い基盤ができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
①：HICノックアウト細胞を用いて、HICが低酸素状態に置いて影響を及ぼす細胞内シグナル系を同定し、TaxがHICによるHIF-1α/βのヘテロ二量体形性及びHICにより制御を受ける細胞内シグナル伝達経路に及ぼす影響を明らかにする。
②：HBZが相互作用を介してHIF-1αの安定性や細胞内分布などに及ぼす影響を解析し、HBZによるHIF-1α依存的な転写抑制機構を明らかにし、その後、低酸素状態に置いてHBZが影響を及ぼす細胞内シグナル系を同定する。
③：HIF-1αノックアウトHTLV-1感染細胞株の樹立を試みる、不可能であった場合にはshRNAにより発現を抑制させ、HTLV-1感染細胞に於けるHIF-1αの役割を明らかにする。
④：①及び②で見出されたTax-HIC経路及びHBZによって制御を受ける標的分子の発現をHICノックアウト及びHBZノックダウンHTLV-1感染細胞株において解析し、HBZ及びTaxが制御するHIF-1αシグナル経路の標的分子が同定する。その後、種々HTLV-1感染細胞株を上記標的分子の阻害薬あるいはsiRNAもしくはshRNAで処理し細胞増殖やウイルスゲノム複製に関する解析を行い、上記解析で見出されたどの標的分子がHIF-1αの機能の主役であるかを明らかにする。
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