好酸球ペルオキシダーゼ抗体の存在から難治性好酸球性気道炎症の新たな治療戦略を探る

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K07949
• Research Institution: Kansai Medical University
• Principal Investigator: 小林 良樹 関西医科大学, 医学部, 講師 (10375298)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 神田 晃 関西医科大学, 医学部, 講師 (70375244)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 好酸球ペルオキシダーゼ抗体 / 好酸球性ムチン

Outline of Annual Research Achievements

今年度は、抗EPX抗体の存在を明らかにするために、ELISA法の確立とWestern blottingによる検証に着手した。
Recombinant EPXを固相化したプレートにサンプル（ムチン上清や血清）を注入し、EPXに結合したIgG抗体をBiotin-IgGを用いて検出する方法を確立した。(1)サンプルを希釈すると検出濃度が希釈濃度依存性に減少すること、(2)予め固相化したrecombinant EPXと反応させた後に回収したサンプル（上清）を用いると検出濃度が固相化に使用したEPX濃度依存性に減少することを確認し、ELISAによる検出方法の信憑性を評価することができた。また、Western blotting法によって視覚的に抗EPX抗体の存在を確認した。Recombinant EPXを電気泳動し、転写後の膜にムチン上清を反応させて、EPXに結合したIgG抗体をhuman IgG抗体を用いて検出した。別の手法として、A/G agaroseビーズで免疫沈降させたムチン上清内のIgGをターゲットにして、Biotin-EPXを用いて検出する方法も試みた。
さらに、本年度の予算で粘稠度測定装置を購入し、ムチンの粘稠度の測定方法を検証した。5~10mm大のサイズに揃えたムチンの粘稠度を直接かつ経時的に測定することで、視覚的にのみならず定量的に評価することが可能になった。低濃度（0.1μg/ml）のEPX添加により、4時間後以降には有意に粘稠度の低下を認めた。最適な治療効果および安全性（気道上皮細胞に対する傷害性など）を評価するために至適濃度の検討が必要であるが、ムチン分解の治療薬となる可能性が示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ELISA法の確立で、抗EPX抗体の定性および定量を信憑性をもって証明することができるようになった。ムチンのサンプリングが計画通りに進まなかったこともあり、ムチン塊を用いた免疫染色での抗EPX抗体の局在を検証することはまだできていない。ただし、本年度の予算で粘稠度測定装置を購入することができたので、ムチンの粘稠度の測定方法の検証を前倒しで行ってきた。

Strategy for Future Research Activity

サンプリングに伴うコロナウイルス感染のリスクが懸念されるため、しばらくは研究目的のサンプリングは不可能である。そのため、既存のサンプル（凍結保存中のムチン塊や上清）を用いてEPX抗体中和の至適条件（EPX添加によるムチンの粘稠度や上清中の濃度の変動を検討）およびDNase Ⅰ活性とEPX抗体濃度の関連性を検証していく。
さらに、気道上皮培養細胞株BEAS-2Bと末梢血分離好酸球との共培養の系を立ち上げて、DNase I活性の低下におけるEPXの関与を検討する。また、ムチン融解の治療薬としてのEPXの安全性を確認する目的で、気道上皮細胞におけるDNase Ⅰ活性と生存能に対するEPXの直接的な影響も検討する。

Causes of Carryover

試薬購入には不十分な程度の残額のみ生じた。