2019 Fiscal Year Research-status Report
translational research for novel therapy for leukemia utilizing microRNA expression analysis
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19K08321
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
平松 英文 京都大学, 医学研究科, 講師 (40362503)
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2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 急性リンパ性白血病 / マイクロRNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では小児急性リンパ性白血病(ALL)の初発時のマイクロRNA(miR)発現プロフィールの解析結果から、遺伝子型に関わらず一様に高発現のみられるmiR に着目し、その生物学的意義を明らかにすることで新規治療法開発への橋渡しとすることを目的としている。候補miRのうち多くの細胞株で高発現しているmiR-146aの発現レベルを可視化できるmiR sensing lentivirus vectorを作成して、生細胞における同miRの発現を解析してみるとMLL rearrangementを有する細胞株では同miRが高発現しているばかりでなく、細胞により発現レベルに多くのheterogeneityがあることを確認した。HB11;19細胞株（MLL-ENL陽性）を用いて上記vectorシステムを利用し、miR-146a高発現細胞と低発現細胞をソーティングして、増殖性、アポトーシス、薬剤感受性等を検討したが、有意な差は見いだせなかった。次に内因性miR-146aを knock down（KD）する目的でmiR-146a lentivirus vectorを作成し、HB11;19と、同じくMLL-ENL陽性のKOCL44細胞株の内因性miR-146aを抑制し、増殖性、コロニー形成能、NOGマウスへの生着性等を検証した。KDにより増殖性は低下し、コロニー形成能は30～50％抑制、さらにリプレートすることで、よりコロニー形成能が低下した。一方でKDにより免疫不全マウスには逆に高い生着能を有していた。miR-146aが腫瘍形成に関連していることが示されたが、これらの分子的機構を明らかにするためmiR-146a highおよびlowの細胞集団におけるmRNA sequencingを行い、NOTCH1を含む複数の遺伝子がmiR-146aKDにより有意に上昇していることを見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度はmiR-146a KD vectorを作成し、同KDがMLL rearrangementを有する細胞株に及ぼす生物学的影響をin vitro, in vivoで検討した。本年度予定していた、高力価KD vectorの安定的作成、トランスクリプトームの解析など予定通りの進捗状況である。
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| Strategy for Future Research Activity |
予定通り患者検体の収集は終えており、当初計画の患者検体を用いたmiR KD実験の準備は整っているが、研究開始当初のmiR発現解析はマイクロアレイを用いた初期の網羅的解析であったことを勘案し、次世代シークエンサーによるdeposit dataを用いて急性リンパ性白血病におけるmiR発現解析に着手し始めた。開始当時よりも解析可能なmiRの数が増えていることや、臨床データと相関するmiR signatureの検討などが可能となることから、より予後との相関の高いmiR候補（群）の同定が可能になると期待され、併せて進めて行く予定である。
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| Causes of Carryover |
knock down lenti-virus vectorの作成を行う際、十分なKD効果を得るためにbinding siteを複数種類制作して検討する必要が生じたり、高力価のウイルス作成が難しい場合など、大量のウイルス作成が必要になり、その際には時間のみならず経費がかさむ恐れがしばしば発生する。今回の検討では、幸運にも高力価ウイルスを比較的大量に作成することができたため、上記の問題点を大幅に回避することができた。一方で、NOGマウスを使用したin vivoの実験ではマウスへの生着性が高くなかったり、移植マウスの死亡などにより、高価なマウスを多数使用する必要が生じる危険がある。次年度に持ち越した経費は主としてin vivoの実験に使用することで、実験の実行可能性を確実なものにする予定である。
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