2019 Fiscal Year Research-status Report

自己免疫疾患における補体の新たな働きの解明

Research Project

Project/Area Number	19K08786
Research Institution	Hokkaido University
Principal Investigator	岩田浩明北海道大学, 大学病院, 助教 (20397334)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	西江渉北海道大学, 医学研究院, 准教授 (20443955) 氏家英之北海道大学, 大学病院, 講師 (60374435)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	水疱性類天疱瘡 / 病原性抗体 / 抗原枯渇 / 補体 / C1q
Outline of Annual Research Achievements	1）培養細胞を用いてC1qが自己抗原の枯渇を促進するか検証本研究を遂行するにあたり、17型コラーゲンに対するモノクローナル抗体の作成を行った。現在までの病原性抗体（NC16A抗体）をヒトIgG1/IgG4抗体で作成が完了した。非病原性抗体とされるnon-NC16A抗体は、Phage display法で作成を行っている最中である。作成したモノクローナルNC16A抗体は、補体結合能を評価したところIgG1でC1qの結合をみとめた、一方でIgG4は補体結合能がなかった。この結果から作成した抗体は抗原結合部位（Fab)・定常領域（Fc)ともに機能を有したモノクローナル抗体が作成されていると考える。続いて、培養ケラチノサイトに刺激をすると抗原の細胞内取り込みが行われることをウエスタンブロットにて確認した。 2）C1qの結合を阻害する標的薬・抗体の作成抗体とC1qの結合を特異的に阻害する合成ペプチドを作成した。1）で行った補体結合試験に合成ペプチドを添加したところ、濃度依存的にC1qと抗体の結合阻害が生じた。一方で、小分子化合物を複数同様に試したが、いずれの化合物においても高濃度でも明らかな結合阻害効果は確認できなかった。 3）ケラチノサイトによる補体C1qの産生ケラチノサイトを上記で作成した抗体刺激をした後に、補体C1qの遺伝子発現およびタンパク発現を検証したところ、病原性抗体で有意な遺伝子発現の上昇が認められた。しかし、ウエスタンブロットによるタンパク発現では検出できなかったため再検証を行っている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 培養細胞およびマウスを用いた実験系は、既に確立できている。そのため最も困難が予想される部分は、病原性抗体・非病原性抗体をモノクローナル抗体で作成する行程であると考えている。すでに病原性抗体は樹立できたため、非病原性抗体の樹立に取り掛かっている。当初の予定では、我々の所有するマウスモノクローナル抗体の一つから可変領域の遺伝子配列を決定し、モノクローナル抗体の作成を行う計画でいた。しかし、配列は決定できたものの合成遺伝子を用いた抗体作成で賛成が得られなかった。様々な条件を検討したが、解決に至らないため新規に患者血液からPhage display法を用いて新たに抗体を作成することとした。全く当教室では新規技術であったため、時間は要しているが徐々に結果は出始めているため次年度には作成可能であると考えている。並行して進めている治療薬探求の研究は、既に合成ペプチドによる阻害実験は成功した。しかし、合成ペプチドでは将来的な創薬に外用剤として用いることが困難であるため、この点を克服するための小分子化合物による阻害実験の成功が望ましい。この点に関しては、現在は既報告を中心に複数の化合物による阻害効果を検証しているが、他施設などが保有するライブラリーを用いた研究を行うか今後検討が必要である。
Strategy for Future Research Activity	おおむね計画は順調に進んでいる、そのため当初の計画通り、まず非病原性抗体の作成をすでに開始しているPhage display法を用いて樹立することに専念する。樹立できた後には、既に確立している実験系で細胞・マウスを用いた実験を遂行する。マウス実験は、将来的にはノックアウトマウスを用いる計画をしているが、現時点ではまだ胚保存の状態であり、計画の進捗が順調であれば起こし作業に取り掛かる予定である。低分子化合物の探求は、ライブラリーを用いた探求に進むか、非病原性抗体作成の際に使用したPhage display法を応用して親和性ペプチドの探求に変更するか今後の進捗状況を見て柔軟に対応をすることを予定している。