2020 Fiscal Year Research-status Report
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19K08841
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
八尾 尚幸 九州大学, 医学研究院, 助教 (90835282)
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2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 多発性骨髄腫 / 間葉系幹細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
骨髄には正常血球細胞の生存や分化、増殖を支持する微小環境が存在している。このことから、多発性骨髄腫患者の骨髄において、骨髄微小環境が骨髄腫細胞の生存と増殖を支持しているものと考えた。また、骨髄微小環境により化学療法後の微小残存病変や薬剤に対する耐性化が引き起こされ、骨髄腫の完治を困難にしていると考えられた。我々は骨髄微小環境を構成する細胞の一つであり、正常血球細胞の生存や分化に重要な役割を果たしている間葉系幹細胞に着目して研究を行っている。間葉系幹細胞が骨髄腫細胞の生存と増殖に及ぼす影響とそのメカニズムを明らかにし、間葉系幹細胞を治療標的とした新規治療法の確立を目指している。
マウス骨髄腫細胞株5TGM1細胞をC57BL6/KaLwRijHsdマウス(以下KaLwRijHsdマウス)に移植して作製した骨髄腫マウスモデルの観察では、5TGM1細胞の微小血管周囲へ生着と、血管に沿った増殖・進展を共焦点顕微鏡で確認することができた。血管周囲には間葉系幹細胞の存在が確認されており、正常造血と同様に間葉系幹細胞が骨髄腫の微小環境の中心的な役割を果たしていると考えられた。
C57BL6マウスに移植された5TGM1細胞は、KaLwRijHsdマウスに移植された場合と比較して骨髄において安定した生着と増殖が認められない。我々は骨髄腫のニッチを形成する間葉系幹細胞に違いがあるものと考え、C57BL6マウスとKaLwRijHsdマウスの間葉系幹細胞をそれぞれ単離し、RNAシーケンス法でそれらの細胞の遺伝子発現を比較した。KaLwRijHsdマウスの間葉系幹細胞では、C57BL6マウスと比較して、いくつかの分泌タンパクの遺伝子発現が低下しており、特定の分泌タンパクの発現量が低いことで5TGM1細胞の生存と増殖に有利に働くものと現時点では考えて解析を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
マウス骨髄腫細胞株5TGM1細胞に蛍光タンパクmonomeric Kusabira-Orange 1 (mKO1)遺伝子を導入し、mKO1を発現する5TGM1-mKO1細胞を作製した。この5TGM1-mKO1細胞をKaLwRijHsdマウスに移植し、共焦点顕微鏡で5TGM1-mKO1細胞の微小血管周囲への生着と、血管に沿った増殖と進展を確認した。また、フローサイトメーターでもKaLwRijHsdマウス骨髄内の5TGM1-mKO1細胞を正常形質細胞と識別して確認し、5TGM1-mKO1細胞の増殖を確認した。
骨髄血管周囲の間葉系幹細胞は骨髄細胞のCD45陰性Ter119陰性CD31陰性CD51陽性CD140a陽性分画に存在していることが報告されており、我々はC57BL6マウスとKaLwRijHsdマウスのそれぞれの骨髄から間葉系幹細胞をセルソーターで単離した。C57BL6マウス骨髄とKaLwRijHsdマウス骨髄における間葉系幹細胞の細胞数には有意な差は認められなかった。単離した間葉系幹細胞からRNAを抽出し、それらの細胞の遺伝子発現をRNAシーケンス法で比較した。KaLwRijHsdマウスの間葉系幹細胞では、C57BL6マウスの間葉系幹細胞と比較して、いくつかの分泌タンパクの遺伝子発現が低下していることを確認した。これらの分泌タンパクのうち、発現量が低いことで5TGM1細胞の生存と増殖に有利に働く特定の分泌タンパクが存在しているものと現時点では考えている。現在、RNAシーケンス法で得られた候補分子の中から5TGM1細胞の生存や増殖に影響を与える分子の同定を試みている。
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| Strategy for Future Research Activity |
RNAシーケンス法で得られた候補分子の精製タンパクを5TGM1細胞の培養液に添加し、MTTアッセイ法やAnnexinⅤ/PI染色法を用いた解析などにより、それらの5TGM1細胞の生存や増殖に与える影響を観察する。責任分子が同定でき次第、CRISPR法を用いて単離した正常間葉系幹細胞の候補分子の遺伝子を欠失させ、5TGM1細胞と共培養を行い、5TGM1細胞の生存や増殖への影響を確認する。骨髄腫細胞ではNF-κBシグナル経路やWnt/β-cateninシグナル経路などの細胞増殖シグナル経路の活性化が報告されており、候補分泌タンパクのそれら既知の増殖シグナル経路や、これまで未報告のシグナル経路との関連性について解析を行う。
さらに、CRISPR法を用いて責任分子のコンディショナルノックアウトマウスの作製を行う。間葉系幹細胞のマーカーの1つであるレプチン受容体でCreが発現するレプチン受容体-Creマウスと、責任分子のコンディショナルノックアウトマウスを掛け合わせることで、間葉系幹細胞特異的に責任分子を欠失させ、このマウスに5TGM1細胞を移植して生着と増殖を共焦点顕微鏡やフローサイトメーターを用いて観察し、骨髄腫の微小環境における責任分子の役割を明らかにする予定である。上記実験で責任分子が治療標的となりうる可能性を確認できれば、責任分子タンパクの治療薬としての可能性について骨髄腫モデルマウスを用いたin vivoの実験系で確認を行う予定である。また、骨髄腫マウスモデルから得られた結果が、実際に骨髄腫患者の病態を反映しているかをヒト骨髄腫細胞株や多発性骨髄腫患者検体を用いて確認を行う。
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Research Products
(2 results)
