2019 Fiscal Year Research-status Report
Development of the new multidrug-resistant tuberculosis control method to use bacteriophage lysin
| Project/Area Number |
19K08953
|
|---|
| Research Institution | Kochi University |
|---|
Principal Investigator |
松崎 茂展 高知大学, 医学部, 特任准教授 (00190439)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山本 哲也 高知大学, 教育研究部医療学系臨床医学部門, 教授 (00200824)
内山 淳平 麻布大学, 獣医学部, 講師 (20574619)
渡辺 茂 高知大学, 教育研究部総合科学系複合領域科学部門, 教授 (70253333)
福田 憲 高知大学, 教育研究部医療学系臨床医学部門, 准教授 (70335751)
北村 直也 高知大学, 教育研究部医療学系臨床医学部門, 講師 (70351921)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
|
| Keywords | ファージ療法 / 抗酸菌 / ライシン |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本件研究では、ファージY10が保有する溶菌酵素（ライシン）を利用する結核菌制御法の開発を目指している。低病原性迅速発育抗酸菌であるスメグマ菌は、ファージY10に対して結核菌と同様の感受性を示すことが知られている。
そのため、まずスメグマ菌に対するライシンの溶菌測定条件の検討を行なった。抗酸菌は、コードファークター産生の故に、液体培地では紐状構造となるため、吸光度測定を使用するファージやファージライシンのインビトロ活性の計測が極めて困難である。そのため、培地中に結核菌培養で使用されるTween20をLB培地に添加すると、菌は均一になるものの、ファージの増殖活性が著しく抑制されることが分かった。そのため、ライシンに対しても抑制的に働く可能性があるため、他の界面活性剤の有用性をスクリーニングすることにした。まず、9種類の界面活性剤について、0.5％濃度の添加により、ファージY10の増殖に影響があるか否かを検討した。その結果、CHAPS,n-Octyl-β-D-glucoside, Sodium cholate, MEGA-8,n-octyl-β-D-maltosideの4種においては、ファージの活性は大きく低下することはなかった。次に、これら4種の界面活性剤を各種濃度で添加したLBにおける、菌の増殖及び菌拡散状況について検討した。その結果、これら4種の界面活性剤とも、0.01～0.025％の濃度で菌増殖が正常に増殖できることが分かった。また、Tween20ほど強力ではないものの、対照と比較して菌を均一化する拡散効果が認められれた。一方、物理的方法による菌の均一化についても検討した。菌培養液を、短時間超音波処理すると、菌の生存率を落とすことなく均一化できることが分かった。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
他の菌種とは異なり、抗酸菌の菌凝集は、ファージ自体やライシンの溶菌活性の吸光光度計による測定を困難にしている。そのため1ステップ追加検討が必要であったが、本年の研究で、吸光光度計による、酵素活性の予備調整しているライシンの溶菌活性が測定可能になったため、活性ライシンを利用する抗酸菌感染制御開発への道が開けた。
|
| Strategy for Future Research Activity |
現在、種々の条件で大腸菌で発現させたファージライシンの粗サンプルを調製している。このサンプルを、前年度で検討した最も菌凝集を解消する条件で溶菌活性を検討し、至適培養条件を決定する。この条件を使用し精製ファージライシンを大量調製する。またスメグマ菌を種々の菌量でマウス鼻腔に接種し、肺感染モデルを作成する。細胞内抗酸菌に対するライシンの投与効果を確認するため、マウスマクロファージ培養系を用いてスメグマ菌の細胞内侵入系を確立する。ライシンを種々のサイズの金コロイドに付着させ、培養マクロファージに捕食させ、最も捕食率の良いサイズを確定する。
|
| Causes of Carryover |
参加登録していた国際学会が、新型コロナウイルスの影響で次年度へ延期になり、また4月からの異動のため、一部の実験を次年度に移す必要が生じたため。
|
