Development of retroviral replicating vector-mediated prodrug activator gene therapy for biliary tract cancer

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K09208
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 岡村 圭祐 北海道大学, 大学病院, 助教 (90724401)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 平野 聡 北海道大学, 医学研究院, 教授 (50322813) ; 土川 貴裕 北海道大学, 大学病院, 講師 (50507572) ; 佐々木 勝則 北海道大学, 医学研究院, 学術研究員 (60336394) ; 七戸 俊明 北海道大学, 医学研究院, 准教授 (70374353) ; 中村 透 北海道大学, 医学研究院, 助教 (70645796)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 胆道癌 / 遺伝子治療 / ウイルスベクター / レトロウイルス / フェロポルチン

Outline of Annual Research Achievements

胆嚢癌、胆管癌、乳頭部癌を含む胆道癌は、南アメリカや東アジアでは罹患率が高く、なかでも、日本人は他の東アジアの人やアメリカの日系人と比べても罹患率が高い傾向にある。胆道癌に対する有効な治療法は手術のみとされ、標準化学療法が確立できていない。そこで、胆道癌に対する化学療法とは異なる新しい治療戦略の開発が重要である。これまで、ウイルスを応用した遺伝子治療は有効な手段のひとつとしてその可能性が追及されてきた。しかし、これまで用いられてきたウイルスベクターは腫瘍選択性を持たない弱点に加え、期待するほどの高い遺伝子導入効率は得られなかった。そこで、遠隔転移癌への治療効果を含めた新規遺伝子治療法の開発が急務である。本研究では、胆道癌に対する① 優れた腫瘍選択性、②高い遺伝子導入効率、③確実な抗腫瘍効果を備えた新しい遺伝子治療法の確立を目的とした。胆嚢癌、胆管癌、乳頭部癌を含む胆道癌のうち、令和元年度は肝外胆管癌細胞株４種類、TFK-1、EGI-1、KKU-100およびTYBDC-1に対する腫瘍選択的増殖型レトロウイルス（replicating retroviral vector; RRV）の感染・拡散効果について、emerald GFP発現RRV (RRV-GFP)を用いてフローサイトメトリー(FCM)にて示した。一方、本研究の治療遺伝子である細胞内の鉄イオンを汲み出す細胞膜蛋白質フェロポルチン（Ferroportin 1）をコードする遺伝子SLC40A1 cDNAをemerald GFP cDNAと置換したpAC3-SLC40A1プラスミドを作製し、粗ウイルス液RRV-SLC40A1を調製した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

１．４種類の肝外胆管癌細胞株においてRRVの感染・拡散効果を示すことができたため、本研究の治療遺伝子であるフェロポルチンの抗腫瘍効果を評価する実験系が確立した。
２．RRVに搭載可能な外来遺伝子のサイズは～1,400塩基対(bp)とされている。これに対して、フェロポルチンをコードする遺伝子SLC40A1 cDNAは1,716 bp であることから、RRV-SLC40A1の作製が困難であることが予想されたが、ウイルスベクターを含む粗ウイルス液を調製することができた。

Strategy for Future Research Activity

１．肝外胆管癌細胞株に対するRRV-SLC40A1殺細胞効果の検討：RRV-SLC40A1、RRV-GFPおよびRRV naive(外来遺伝子を含まない) を４種類の肝外胆管癌細胞株に感染させた後、細胞増殖能の変化を示す。増殖が盛んな癌細胞は正常細胞に比べてより多くの鉄イオンを必要とすることから、細胞培養時に使用する培地から鉄イオンを除去する目的で、実臨床で使用されている鉄キレート剤（Deferasirox/EXJADE、Deferoxamine）を用い、除鉄処理による細胞増殖抑制増強効果を示す。
２．同所移植マウスモデル作製：４種類の肝外胆管癌細胞株のうち、同所移植マウスモデルを作製することが可能な細胞株を決定する。使用する細胞株にルシフェラーゼ遺伝子を導入し、安定株をクローニングした後、同所移植モデルマウスを作製する。基質であるD-ルシフェリンを投与し、経時的に腫瘍容積の変化を発光イメージングシステムIVISで示す。
３．同所移植マウスモデルにおけるRRV感染・拡散効果の検討：RRV-GFPを投与後、経過を追って腫瘍を摘出しgentleMACS homogenizerにより細胞を分離し、FCM解析にてGFP陽性細胞率を測定しin vivoでの感染・拡散効果を示す。