2020 Fiscal Year Research-status Report

Novel treatment for intracranial hemorrhage using amnion derived mesenchymal stem cells

Research Project

Project/Area Number	19K09539
Research Institution	Hyogo Medical University
Principal Investigator	吉村紳一兵庫医科大学, 医学部, 教授 (40240353)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	高木俊範兵庫医科大学, 医学部, 講師 (00452152) 内田和孝兵庫医科大学, 医学部, 講師 (10570674) 白川学兵庫医科大学, 医学部, 講師 (50425112) 山原研一兵庫医科大学, 医学部, 准教授 (50450888) 中込隆之兵庫医科大学, 医学部, 教授 (80434950) 蔵本要二兵庫医科大学, 医学部, 講師 (10604275)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	脳出血 / 羊膜由来幹細胞 / 間葉系幹細胞
Outline of Annual Research Achievements	本研究の目的は、羊膜由来MSCを用いた脳出血モデルに対する神経機能改善を確認し、そのメカニズムを明らかにすることである。本研究ではMSCによる神経機能改善メカニズムを免疫反応に着目して検討することにある。昨年度はマウス脳出血モデルを作成し、投与量ならび投与時期について検討した。具体的には脳出血誘導後、10^5個の高用量群とその4分の1量の低用量群との２つの投与量を24時間後に投与した、用量最適目的の試験ならび10^5個の高用量を24時間と72時間後に羊膜由来MSCの静脈投与を行う時期最適目的の試験を行い、その神経機能改善の関連を検討した。行動実験において、オープン水泳テスト、受動回避テスト、水迷路試験で高用量かつ24時間投与の羊膜由来MSC投与がより改善を認めた。神経機能改善メカニズムの解析として、フローサイトメトリーを用いた解析では脳内おいてCD11陽性かつCD45陽性細胞つまりマクロファージやミクログリアと考えられる細胞数が羊膜MSCを投与により減少していることがわかった。本年度は機序の解析としてPCRならびWestern blottingをおこなった。PCRでは細胞投与に伴って、大きく動く、炎症や抗炎症に関与する遺伝子は認めなかった。Western blottingによる脳出血部位の蛋白解析では腫瘍壊死因子(TNF)や誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)が細胞投与により減少していることがわかった。それを制御するpathwayを引き続き検討中であるが、現時点ではそれは見つかっていない。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason COVID19の影響で動物実験施設が閉鎖した時期があり、そのため、実験がやや遅れている。今後、メカニズム解析をさらにすすめていく上で、動物実験施設の使用は必須である。使用可能なところで、サンプル作成を先行する。来年後は最終となるため、実験のまとめ、必要な追加実験を行う。
Strategy for Future Research Activity	今後、メカニズム解析には、脳出血モデルを作成し、細胞投与群と溶媒群との比較検討が必要である。PCRやウエスタンブロットの解析で主だった制御経路は検討した。今後は神経栄養因子や保護因子にも範囲を広げ実験を継続していく。いままでの、動物実験、フローサイトメトリー、免疫組織ならびウエスタンブロットの結果をもとに、現在論文を作成しており、研究期間内に論文の採択を目指す。
Causes of Carryover	COVID19の流行により、学会参加ならび発表がなくなったこと、また、動物実験が一時ストップしたため、支出が減ったことに起因する。次年度は機序解析を更に行いかつ、学会参加が不透明であるため、その分、英文誌への論文投稿に力を入れる。すでに今までの成果で論文作成がほぼ終盤となっており、今後英文添削・論文掲載料が必要となる。