腎前駆細胞の選択的抽出により機能的な構造を有する腎を再生するための基礎研究

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K09678
• Research Institution: Nagoya City University
• Principal Investigator: 中根 明宏 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 准教授 (70464568)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 西尾 英紀 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 助教 (10621063) ; 林 祐太郎 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (40238134) ; 安井 孝周 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (40326153) ; 丸山 哲史 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (50305546) ; 水野 健太郎 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 准教授 (70448710)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 再生医療 / ES細胞 / 腎

Outline of Annual Research Achievements

Pax2 ES細胞を用い、5% CO2、37で、培養液はGlasgow MEMに10% FCS、10-4M 2-メルカプトエタノール、non-essential aminoacid、1mM sodium pyruvate、 1000U/ml LIF(leukemia inhibitory factor: ESGRO)を加えたもので培養する。Pax2 ES細胞をLIFを除いた培養液中でhanging drop法を用い、胚様体(EB)を形成させる。5日後にEBを再度ディッシュに付着させ、分化を進めて、10日目でEBを0.25%トリプシンEDTA溶液にて回収し、TRISol、クロロホルムにてmRNAを抽出、2-プロパノール、エタノールにて沈殿させ回収する。回収したEBはRT-PCR法でPax2遺伝子が発現していることが確認できた。また他の腎発生の各段階で発現 してくる遺伝子に変化がないかどうかをRT-PCR法を用い確認したところ、aquaporin-1、Integrin a8、BMP4、BMP7、Pax8、Podocinの発現上昇が認められた。そこで、これらのEBをPax2発現細胞に対し、Pax2で標識した細胞を回収する条件でFACSを行い、細胞回収を行った。これらの細胞に対し、再度上記の遺伝子の発現が上昇しているかをRT-PCR法で確認したところ、aquaporin-1の上昇が確認できた。さらにBMP4、BMP7、Pax8の発現上昇や、糸球体に発現するPodocinの発現を確認できた。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

FACSを行い、目的となる細胞の発現遺伝子は確認できた。BMP4、BMP7、Pax8の発現上昇や、糸球体に発現するPodocinの発現を確認できた。他の遺伝子の発現がないかどうかの確認に時間を要している状態である。

Strategy for Future Research Activity

FACSやPCRの結果から腎構成細胞の再生のメカニズムの一端が確認できたが、引き続きの培養条件の設定を要すると思われる。

Causes of Carryover

腎・尿管発生に重要な遺伝子Pax2をES細胞に遺伝子導入し、培養・分化させる計画であったが、培養・分化が計画通りの結果が得られなかった。遺伝子導入や培養系の方法の見直しを行い計画自体は順調な滑り出しであったがCOVID-19による通常の医療業務が大幅に変更となり、予定していた研究を進めることができなかった。また国際・国内学会出張も計画していたが、出張することもできなかった。このため次年度使用が生じた。次に最終年度として、Embryoid body(EB)の遺伝子発現の確認を行っていきたい。