2019 Fiscal Year Research-status Report
ストレッチ刺激に対するケロイド由来線維芽細胞の病的カルシウムシグナル応答の解明
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19K10009
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
峯田 一秀 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学域), 助教 (70747815)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ケロイド / カルシウムイオン / 伸展刺激 / 病的応答 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
独自の細胞伸展マイクロデバイスを用いて、ケロイド由来線維芽細胞の病的カルシウムシグナル応答について検証した。以前は5分間が限界であったが、30分間のリアルタイム観察を可能とした。正常皮膚由来線維芽細胞(N-FBs)とケロイド由来線維芽細胞(K-FBs)に対して、ストレッチ刺激を付与しながら、細胞内Ca2+濃度の変化を検証することを目的とした。
培養皿に設置したシリコーンゴム製のデバイス上に、N-FBsもしくはK-FBsを播種し培養する。Ca2+蛍光標識薬(Fluo-8H)ならびに細胞質蛍光標識薬を反応させた後、10%ストレッチ刺激を加えつつ（12回/min）、共焦点顕微鏡下に30分間の連続撮影を行った。細胞内Ca2+濃度の変化は、二つの蛍光標識薬の蛍光輝度比で表し、輝度比が1.2以上上昇かつ凸のものを応答(+)と定義した。
結果として、細胞応答率はN-FBｓ群(20.4％)とK-FBs群(23.1％)で有意差はなかった。応答回数は、N-FBｓ群の1回80%，2回10％，3回10%と比較して、K-FBs群では1回50%，2回33％，4回17%であり、複数回応答する細胞が多くみられた。応答開始時間は、N-FBｓ群(916±163秒)と比較して、K-FBs群(450±129秒)では応答開始が速い傾向がみられた。輝度比のピーク値から解析した正常応答のカットオフ値は2.12であり、K-FBs群の11.3%でカットオフ値を超える病的応答がみられた。
両群と約2割でカルシウムシグナル応答がみられ、約8割は反応を示さなかった。今回、K-FBs群で病的応答を示す細胞集団が約1割存在しており、複数回応答する細胞が多いことも含め、ケロイド体質特有のphenotypeであると推察された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ケロイド由来線維芽細胞において、繰り返し伸展刺激を付与した際の細胞内カルシウムイオン濃度の病的上昇を突き止めた。次に、セカンドメッセンジャーの役割を持つカルシウムイオンの細胞内濃度異常の原因を探索するため、細胞内シグナル伝達のどこにターゲットを絞るかで文献的考察が必要であり、やや実験が遅延している。
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| Strategy for Future Research Activity |
正常皮膚由来線維芽細胞およびケロイド由来線維芽細胞ともに、繰り返し伸展刺激に対するカルシウムシグナル応答において、サイレントな細胞集団と応答する集団がみられた。特に、ケロイドでは約1割の細胞集団で、病的な細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を認めたため、シングルセル解析を行って、原因遺伝子を探求することを計画している。
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| Causes of Carryover |
細胞免染とリアルタイムPCRによる遺伝子解析、ウエスタンブロッティングによる蛋白質解析に必要な試薬を2019年度に購入予定であったが、実験がやや遅延しているため、年度内の購入が間に合わなかった。現在、試薬の選定を行っているところであり、決定次第、順次購入していく予定である。
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