2019 Fiscal Year Research-status Report
エクソソームを細胞間コミュニケーションツールとする創傷治癒機構の解明
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19K10038
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| Research Institution | Tokyo University of Science |
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Principal Investigator |
下仲 基之 東京理科大学, 理学部第一部化学科, 教授 (30277272)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | エクソソーム / 創傷治癒 / 灌流培養 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
創傷治癒過程の制御は，細胞外マトリックスや血液中の成分，そして線維芽細胞と血管構成細胞との間の多次元的な相互作用に加え，エクソソームのタンパク質やmiRNAによるタンパク質発現制御などが重要な役割を担っていると考えられる。本研究は，線維芽細胞の3D培養に血管内皮細胞の２D培養を組み合わせた灌流培養を行うことでex vivoの創傷治癒モデル系を確立して細胞間の相互作用を解析するとともに，それぞれの細胞から分泌されるエクソソームの損傷回復に及ぼす影響を検討することで，エクソソームの新たな生理機能を探索し，in vivoにおける創傷治癒過程のメカニズム解明を目指すものである。
本年度は，実験計画に示した線維芽細胞の3D灌流培養の確立及び線維芽細胞と血管内皮細胞との相互作用の解明を行うための条件設定を行った。まず灌流培養系において，血管内皮細胞及び線維芽細胞を安定に維持するための培養条件の最適化を行った。続いて二種類のコラーゲン担体に線維芽細胞を播種して細胞の増殖状況を観察することで，３D培養のための条件検討を行った。さらに，二成分灌流培養系によってエクソソームを介した制御機構の解明を行うために，それぞれの灌流培養系にエクソソームを添加しスクラッチアッセイを行うことで，損傷回復に対する影響を検討した。その結果，内皮細胞及び線維芽細胞から調製したエクソソームはいずれも細胞に対しても損傷修復を促進することが明らかとなった。
以上のように本年度は，灌流培養を用いて創傷治癒過程における血管内皮細胞と線維芽細胞の相互作用を評価するための系の確立に成功することができた。次年度以降は，この系を用いてそれぞれの細胞由来のエクソソームの影響を詳細に検討するとともに，エクソソーム由来のmiRNAのスクリーニングを行うことで，その作用発現のメカニズムの解明を試みていく予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度はまず，灌流培養系を用いて血管内皮細胞及び皮膚線維芽細胞それぞれを安定に培養するための条件設定を行った。ミヌシートのガラス上に細胞を播種しコンフルエントになるまで培養し，その後ミヌシートを培養チャンバーにセットして様々な条件下で灌流培養を行なった。その結果，0.1 M HEPES，5％ウシ血清を含むDMEMを用い，流速1.5 ml/h～4.5 ml/hで灌流した場合，７日以上培養可能であることがわかった。また培養チャンバーのサイズを検討したところ，血管内皮細胞は６スロットチャンバーの方が24スロットチャンバーより安定に培養できることがわかった。それに対し皮膚線維芽細胞は，どちらのチャンバーでも安定性に差は認められなかった。
血管内皮細胞及び皮膚線維芽細胞を無血清培地中で48時間培養した後，連続超遠心分離法によりエクソソームを調製した。得られたエクソソームを用いて，創傷治癒に対する影響を灌流培養系でのスクラッチアッセイにより検討した。ミヌシート上でコンフルエントになった細胞を培養チャンバーにセットして灌流培養を開始し，24時間後に細胞に引っかき傷をつけ，継時的に傷が修復する様子を観察した。それぞれの細胞由来のエクソソームを血管内皮細胞または皮膚線維芽細胞の灌流培養系に添加したところ，いずれの場合も損傷回復を促進することが明らかとなった。
皮膚線維芽細胞の3D灌流培養を行うために，コラーゲンスポンジハニカム及びコラーゲンスポンジマイティーを用いた静的培養系で３D培養の条件について検討した。その結果，コラーゲンスポンジマイティーを用いた方がより高密度で皮膚線維芽細胞が担体に接着し安定に培養できることがわかった。
以上のように，本年度は次年度以降実験を行うための条件設定を行い，良好な結果を得ることができたことから，ほぼ順調に研究が進行していると判断することができる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は本年度に得られた結果をもとに，コラーゲン担体に線維芽細胞を播種した3D培養体に血管内皮細胞の２D培養系を組み合わせて灌流培養を行う創傷治癒のex vivoモデル培養系を構築し，その系を用いて様々な血液タンパク質や血球成分との関連を評価するとともに，培養系に存在するエクソソームが細胞増殖の制御や細胞外マトリックスの合成・分解等にどのような影響を及ぼすかを明らかにすることで，瘢痕形成に重要な影響を与える過程である細胞増殖期と組織再構築期における細胞間コミュニケーションの動的変化を解析する。
具体的には，線維芽細胞の3D培養装置の上流に血管内皮細胞の2D培養装置を直列に接続した二成分灌流培養系を構築する。この装置を用いた灌流培養条件下で血管内皮細胞に損傷を与え，血管内皮細胞が損傷から回復する過程に応じて線維芽細胞の増殖能や遊走能，プロテアーゼの合成・分泌量，マトリックス成分の蓄積，細胞内シグナル伝達因子の発現パターン等がどのように変化するかを検討する。ここで現れた変化に対するエクソソームの関与を明らかにするために，構築した二成分灌流培養系の流路内にエクソソームを吸着させるトラップを設置してエクソソームの流れを遮断し，どのような影響が生じるかを検討する。続いて，それぞれの細胞から分泌されたエクソソームをトラップから回収し，それらのエクソソームに存在するmiRNAの解析を行う。 解析したmiRNAの標的となる分子を特定し，それらの発現量の変化について検討することで，miRNAと標的タンパク質との相互作用について検討する。得られた解析結果をもとに候補となるmiRNAを選択し，二成分灌流培養系にそれらのmiRNAを添加して線維芽細胞に対しどのような影響を及ぼすかを検討することで，エクソソームに存在するmiRNAの役割を明らかにしていく。
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| Causes of Carryover |
血管内皮細胞及び皮膚線維芽細胞の灌流培養の条件及び線維芽細胞の３D培養の担体を検討した結果，消耗品費が当初想定していた金額よりも少額で対応できることが明らかとなったため，一部次年度へ繰越すこととした。
次年度の研究計画ではmiRNAの解析を委託するための予算が増加する可能性があるため，繰り越しとなった余剰金をそのための追加費用として使用する予定である。
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