放射線誘発発がん変異のゲノム・エピゲノムシグニチャーの解明

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K12323
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 鈴木 啓司 長崎大学, 原爆後障害医療研究所, 准教授 (00196809)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 放射線 / 甲状腺 / 発がん / DNA損傷

Outline of Annual Research Achievements

放射線被ばくによる健康影響として発がんがよく知られているが、放射線発がんの分子メカニズムの全貌は未だに未解明のままで、発がんに関連するドライバー変異も、大半の固形腫瘍では同定されるに至っていない。唯一、放射線起因の小児甲状腺がんでは、高頻度に見られるドライバー変異として、RET/PTC等の遺伝子融合型変異が報告されているが、これらの発がん変異が、放射線被ばくにより直接誘起されたものかどうかは実際のところ定かではなく、その検証なしには、放射線発がんの分子メカニズムの解明、ひいては、放射線発がんリスクのモデルの科学的妥当性の議論はかなわない。本研究では、『放射線誘発の発がん変異は被ばく特有のゲノム・エピゲノムシグニチャーを留める』との仮説を、本研究課題の核心をなす学術的「問い」として位置づけ、正常ヒト甲状腺濾胞由来培養細胞を用いて、放射線照射によって実験的に直接誘発された遺伝子融合型発がん変異においてこれを証明する研究計画である。
令和2年度は、正常ヒト甲状腺濾胞細胞に、1～10 Gyまでのγ線を照射、103個の細胞毎にサブグループ化し、GeneRead Pure mRNA kitを用いてmRNAを精製し、cDNAに変換した後に、融合遺伝子の両側に設定したプライマーを用いて、SYBR Premix Ex Taq IIによる定量的Real-time PCR（Thermal Cycler Dice real-time system）により融合遺伝子の発現が確認されたクローンから、融合遺伝子領域をKOD FXを用いたPCRにより増幅し、ExoSAP-IT PCR clean-up reagentによりPCR産物を精製した後に、Big Dye Terminator sequencing kit version 3.1を用いて、BI3730 automated sequencer により塩基配列の決定を進めているところである。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初計画した年次計画に従って、研究が進捗しているため。

Strategy for Future Research Activity

令和3年度は、得られた細胞集団を更にサブグループ化し、解析を繰り返し実施することにより、ドライバー変異を有するクローンを特定。ドライバー変異クローン細胞をフォルマリンで固定後に、細胞を粉砕し、ChIP-IT Express Shearing Kitsにより、クロマチンを断片化する。CHIP解析には、Active Motif社のCHIP-IT Express kitを用いて、融合遺伝子配列上に設計した多重プライマーを用いた定量的Real-time PCRにより解析を行い、エピゲノムシグニチャーを特定する。エピジェネティックマークとしては、ヒストンH3のメチル化（K9、K36）、ヒストンH4のメチル化（K20）、およびヒストンH3のアセチル化（K27）の解析を計画しており、ヒストンH2AXのS139のリン酸化によりDSB部位の局在性を確認する。これらエピジェネティックマーク解析用のChIP抗体は、Active Motif社から入手する。