2019 Fiscal Year Research-status Report
ミスマッチ修復機構によるPCNAダイナミクス制御メカニズムの解明
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19K16042
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
河添 好孝 九州大学, 理学研究院, 特任助教 (60805422)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | PCNA / アンローディング / ミスマッチ修復 / クランプローダー / ツメガエル卵抽出液 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
複製クランプPCNAは多様な因子の足場として機能し、DNA複製だけではなく、ミスマッチ修復（MMR）機構によるDNA合成エラーの修復にも中心的な役割を果たす。PCNAのDNA上でのダイナミクスは、クランプローダー複合体（RFC、Ctf18-RFC、Elg1-RFC）によって制御される。RFCとCtf18-RFCはPCNAのローダーとして、Elg1-RFCはアンローダーとして機能すると考えられている。一方で、試験管内ではRFCやCtf18-RFCもPCNAのアンローディング活性を示すが、生体内でどのような役割を持っているのかは明らかでない。また我々は、PCNAアンローディングがMMR機構によっても制御を受けることを見出したが、アンローディングのどのステップを阻害しているのかは分かっていない。
本研究者は、ツメガエル卵抽出液を用いてDNAに予め結合させたPCNAのアンローディング反応を解析した。ツメガエル卵抽出液中では、Elg1-RFCがPCNAアンローディングを担う責任因子であり、Elg1-RFCのATP加水分解活性は、PCNAをDNAからアンロードするために重要であった。さらに、精製Elg1-RFCを用いてPCNAアンローディング反応の試験管内再構成に取り組んだ。興味深いことに、精製Elg1-RFCは卵抽出液中では活性を示したものの、単独ではPCNAをアンロードできなかった。この結果は、未同定の因子によってElg1-RFCのPCNAアンローディング活性が制御されている可能性を示唆しており、現在卵抽出液を用いて、その因子の探索ならびにその影響についての解析を行っている。
卵抽出液を用いた解析から、PCNAと結合性のあるペプチド断片を加えるだけで、PCNAアンローディングが大きく遅延することが明らかとなった。現在、どの過程がペプチド断片によって阻害されているのかに着目し、解析を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
精製Elg1-RFCを用いた再構成実験からElg1-RFCがPCNAをDNAからアンロードするためには、未同定の因子が必要である可能性が示唆された。現在、卵抽出液を用いてその因子の同定と、その因子によるPCNAアンローディングに対する影響についての検討を進めている。
また、PCNAアンローディングの制御メカニズムの一つとして、DNA上のPCNAが何らかの因子と相互作用している場合は、その因子によってPCNAのDNAからのアンロードが阻害される可能性を考えている。卵抽出液を用いた解析は順調に進んでいるものの、先述の通りPCNAアンローディング反応の試験管内再構成系の構築が遅れていることもあり、今後さらなる解析が必要であると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
Elg1-RFCは卵抽出液中での活性は確認できているが、精製タンパク質のみを用いた解析を進めるために、必要因子の同定、解析条件の検討が今後の研究課題となる。Elg1-RFCの精製度を高めることも同時に行う。また卵抽出液を用いた解析についても、現在はDNAに予め結合させたPCNAのダイナミクスに主に着目しているが、PCNAアンローディングを制御する因子も含めたDNA上での反応制御を理解するためにも、DNA上のタンパク質の挙動も同時に解析し、PCNAがDNAからアンロードされるタイミングや状況を明らかにする。
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