2020 Fiscal Year Research-status Report
液－液相分離によって生じるオートファゴソーム形成場の高速AFMによる観察
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19K16344
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| Research Institution | Microbial Chemistry Research Foundation |
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Principal Investigator |
能代 大輔 公益財団法人微生物化学研究会, 微生物化学研究所, 博士研究員 (90751107)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | オートファジー / 液―液相分離 / 液滴 / 高速原子間力顕微鏡 / 天然変性タンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
オートファジーは、酵母からヒトに至る真核生物に保存された機構であり、タンパク質や細胞内小器官、異物等をリソソーム（液胞）へ輸送し分解する。オートファジーが開始されると隔離膜が分解対象物を取り囲み、オートファゴソームが形成されリソソーム（液胞）と融合する。酵母において、隔離膜形成には前オートファゴソーム構造体(PAS)が重要な役割を持ち、その足場はAtg1-Atg13-Atg17-Atg29-Atg31タンパク質複合体によって形成されるが、この複合体は液―液相分離して球状の「液滴」となることが見出された。
本研究は、高速原子間力顕微鏡(AFM)を用いて液滴の構造的な理解を深め、オートファゴソーム形成メカニズムの解明につなげることを目指す。
本年度は、液―液相分離が関与するオートファゴソーム形成について、酵母だけでなく、哺乳動物にも研究を展開するため、ヒトのオートファジー関連タンパク質p62/SQSTM1（以降p62）の液滴形成についての研究を行った。p62は、ポリユビキチン化されたタンパク質凝集体をリソソームでの分解へと導く選択的オートファジーの受容体タンパク質として知られている。p62は隔離膜（オートファゴソーム膜）に局在するLC3 (Atg8ホモログ)と結合するためのLIR (LC3-interacting region)を持つ。p62はユビキチン鎖との結合により液―液相分離して液滴を形成する。
本年度は、隔離膜を模倣したAtg8結合GUV (巨大単層ベシクル)を用いた試験管内再構成実験により、p62液滴はGUV膜に結合すること、さらにp62 LIR変異導入体を用いて、p62液滴とGUV膜との結合がLIR依存的に生じることを蛍光顕微鏡を観察によって示した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、ヒトの選択的オートファジーの受容体タンパク質として知られるp62について、p62液滴が隔離膜に包みこまれていく様子を試験管内再構成実験で再現することを試みた。その結果、p62液滴の膜への結合と、その結合のLIR依存性を示すことができた。このことは、共同研究の成果の一部としてNature Communications誌に掲載された。
また、高速AFMを用いて、酵母のPASの足場構成因子であるAtg1およびAtg13をはじめとする天然変性タンパク質をイメージングすることにより、得られたひも状領域の長さから天然変性領域を構成するアミノ酸のおよその数が求められることをNature Nanotechnology誌に報告した。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続きオートファジー関連タンパク質で液滴を形成するもの、あるいは液滴の形成に関与するものについて、高速AFMや蛍光顕微鏡を用いた観察を進めていく。それと同時に、高速AFMで液滴の性質を評価する方法、および細胞の内部に生じた液滴をイメージングする方法を探っていく。
p62によるオートファゴソーム形成場の試験管内再構成実験に関しては、ユビキチンをタンデムに4個連結させたユビキチン鎖で形成させたp62液滴は膜への結合はみられるものの、膜の陥入までは観察されなかった。膜変形を惹起するような液滴を形成する条件を探り、オートファゴソーム形成の試験管内での再現を目指す。
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