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2020 Fiscal Year Research-status Report

ミクログリア由来エクソソームによる神経障害性疼痛のメカニズム解明

Research Project

Project/Area Number 19K18241
Research InstitutionThe University of Tokushima

Principal Investigator

加納 史也  徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 助教 (40801626)

Project Period (FY) 2019-04-01 – 2022-03-31
Keywordsミクログリア / エクソソーム / 神経障害性疼痛
Outline of Annual Research Achievements

マウス384 SeraMir qPCR profilerを用いて上記3群マウスの血清およびミクログリア由来エクソソームのmiRNAの発現パターンを比較した。また TaqMan Array Rodent MicroRNA A+B Cards Setを用いてmiRNAの正確な定量評価を行った。 マウス血清エクソソームでは、Sham群と疼痛群、疼痛群と治療群マウスでそれぞれ5倍以上増減するmiRNAの絞り込みを行った。候補miRNAはSham群と疼痛群で33種、疼痛群と治療群で19種に絞り込みを行った。in vitroでは、マウス由来ミクログリア(M0ミクログリア)をLPSとIFN-γを添加し、活性型へ誘導した(M1ミクログリア)。M0とM1が由来のエクソソームついても同様に実験を行った。マウス血清由来エクソソームと同様にmiRNAの絞り込みを行ったが、in vivoと比較し発現量は低く、またターゲット候補のmiRNAも概ね一致しなかった。我々は、ミクログリア以外の細胞由来エクソソームの影響の検討を行ったが、現時点で明らかなターゲット細胞の同定には至っていない。
マウス血清由来エクソソーム関連miRNAの発現を脊髄後根組織のRT-qPCRで検証を行った。Sham群と疼痛群で33種、疼痛群と治療群で19種だった候補miRNAを脊髄後根組織のRT-qPCRの結果から、さらに疼痛関連miRNA16種、鎮痛関連miRNA 8種に絞り込みを行った。このそれぞれの関連miRNAから、microRNA.orgで入手可能なWeb上の予測ツールを使用し、共通標的遺伝子リストを作成した。
また、本研究中に幹細胞が分泌するエクソソームが活性化したミクログリアを鎮静することを見出した。神経科学分野の国際誌に投稿し、追加実験中である。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

マウス384 SeraMir qPCR profilerを用いて上記3群マウスの血清およびミクログリア由来エクソソームのmiRNAの発現パターンを比較した。また TaqMan Array Rodent MicroRNA A+B Cards Setを用いてmiRNAの正確な定量評価を行った。 マウス血清エクソソームでは、Sham群と疼痛群、疼痛群と治療群マウスでそれぞれ5倍以上増減するmiRNAの絞り込みを行った。候補miRNAはSham群と疼痛群で33種、疼痛群と治療群で19種に絞り込みを行った。in vitroでは、マウス由来ミクログリア(M0ミクログリア)をLPSとIFN-γを添加し、活性型へ誘導した(M1ミクログリア)。M0とM1が由来のエクソソームついても同様に実験を行った。マウス血清由来エクソソームと同様にmiRNAの絞り込みを行ったが、in vivoと比較し発現量は低く、またターゲット候補のmiRNAも概ね一致しなかった。我々は、ミクログリア以外の細胞由来エクソソームの影響の検討を行ったが、現時点で明らかなターゲット細胞の同定には至っていない。
マウス血清由来エクソソーム関連miRNAの発現を脊髄後根組織のRT-qPCRで検証を行った。Sham群と疼痛群で33種、疼痛群と治療群で19種だった候補miRNAを脊髄後根組織のRT-qPCRの結果から、さらに疼痛関連miRNA16種、鎮痛関連miRNA 8種に絞り込みを行った。このそれぞれの関連miRNAから、microRNA.orgで入手可能なWeb上の予測ツールを使用し、共通標的遺伝子リストを作成した。
今後は作成した遺伝子リストを用いて、ノックアウトマウスおよびノックアウト細胞を用いて、遺伝子の働きについて検討を行う。

Strategy for Future Research Activity

疼痛群と治療群において同定した遺伝子群のmRNAをRT-qPCRで比較する。in vitroでは、siRNAを用いた目的遺伝子のノックダウンを行い、M0/M1/M2ミクログリアでの発現変化と、産生される炎症性/抗炎症性サイトカインの変化をRT-qPCRで比較する。またCRISPR-Cas9の使用も検討している。
in vivoでは、siRNA発現AAVベクターの脊髄注入やDesigner Drugs(DREADD)による同定遺伝子の発現抑制を行う。モデルマウスの疼痛評価はvon Fray testで評価し、脊髄L5/L6の組織学的解析とRT-qPCRで遺伝子解析の評価を行う。
本実験によって、末梢から起因する疼痛の慢性化機構や末梢神経と中枢神経の相互関係の一端を明らかにしていく。

Causes of Carryover

2020年度から行う予定だった、siRNA発現AAVベクターの脊髄注入やDesigner Drugs(DREADD)による同定遺伝子の発現抑制実験がコロナの影響により大学施設への立ち入り禁止、試薬の購入困難な状態から実験が止まっていた。そのため、同実験に使用する予定であった研究費が余剰したが、2021年度の実験計画で使用する予定とした。

  • Research Products

    (7 results)

All 2020

All Journal Article (3 results) Presentation (4 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results)

  • [Journal Article] Conditioned Media from Human Dental Pulp Stem Cells Prevent Radiation-induced Skin Injury2020

    • Author(s)
      Keita KAWARABAYASHI, Fumiya KANO, Noboru HASHIMOTO, Hideharu HIBI, Tsutomu IWAMOTO, Akihito YAMAMOTO
    • Journal Title

      Journal of Oral Health and Biosciences

      Volume: 33(1) Pages: 1-7

    • DOI

      10.20738/johb.33.1_1

  • [Journal Article] Factors secreted from dental pulp stem cells show multifaceted benefits for treating experimental temporomandibular joint osteoarthritis2020

    • Author(s)
      Ogasawara N.、Kano F.、Hashimoto N.、Mori H.、Liu Y.、Xia L.、Sakamaki T.、Hibi H.、Iwamoto T.、Tanaka E.、Yamamoto A.
    • Journal Title

      Osteoarthritis and Cartilage

      Volume: 28 Pages: 831~841

    • DOI

      10.1016/j.joca.2020.03.010

  • [Journal Article] Effectiveness of low-intensity pulsed ultrasound on osteoarthritis of the temporomandibular joint: A review2020

    • Author(s)
      Tanaka Eiji、Liu Yao、Xia Linze、Ogasawara Naoko、Sakamaki Takuma、Kano Fumiya、Hashimoto Noboru、Feng Xingmei、Yamamoto Akihito
    • Journal Title

      Annals of Biomedical Engineering

      Volume: 48 Pages: 2158~2170

    • DOI

      10.1007/s10439-020-02540-x

  • [Presentation] Factors secreted from dental pulp stem cells show multifaceted benefits for treating experimental temporomandibular joint osteoarthritis2020

    • Author(s)
      加納 史也, 小笠原直子, 橋本 登, 森 浩喜, 宮嵜 彩, 岩本 勉, 田中 栄二, 山本 朗仁
    • Organizer
      第62回歯科基礎医学会
  • [Presentation] Conditioned Medium from the dental pulp stem cells Ameliorates Neuropathic Pain in mouse Partial Sciatic Nerve Ligation Models2020

    • Author(s)
      加納史也, Liu Yao, 橋本登, 松香芳三, 田中栄二, 山本朗仁
    • Organizer
      第41回日本炎症・再生医学会
  • [Presentation] 歯髄幹細胞由来無血清培養上清は坐骨神経結紮モデルマウスの神経障害性疼痛を改善する2020

    • Author(s)
      加納史也, Liu Yao, 橋本登, 松香芳三, 田中栄二, 山本朗仁
    • Organizer
      第65回日本口腔外科学会総会
  • [Presentation] actors secreted from dental pulp stem cells show multifaceted benefits for Synergistically Regenerate Transected Rat Peripheral Nerves by Altering Macrophage Polarity.2020

    • Author(s)
      Fumiya Kano
    • Organizer
      Japanese Association for Dental Research (IADR)
    • Int'l Joint Research

URL: 

Published: 2021-12-27  

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