肺毛細血管内皮細胞障害に対する水素ガスの有効性の検討

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K18325
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 山田 太平 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 講師 (00465684)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 肺毛細血管内皮細胞障害 / 水素ガス / 酸化ストレスシグナル

Outline of Annual Research Achievements

侵襲下の急性呼吸窮迫症候群(以下ARDS)は、両側肺水腫、低酸素症を特徴とする致死率の高い急性病態である。ARDSでは様々な炎症性メディエーターが病態形成に関与するが、中でも活性酸素種(ROS)は肺毛細血管の拡張と血管透過性の亢進作用により肺水腫の形成に直接的な役割を演じるとされる。本研究では、ヒト肺毛細血管内皮細胞エンドトキシン血症モデルで、肺毛細血管内皮細胞の活性酸素種発現と血管透過性亢進の関連を検討する事で酸化ストレスシグナルの役割を解明し、その発現を水素ガスにより抑制出来るかどうか検討する。ARDSの病態解明の突破口となり、新たな治療戦略や革新的医薬品開発に繋がるプロジェクトである。令和2年度はヒト肺毛細血管内皮細胞エンドトキシン血症モデルを作成し、通常培地と水素飽和培地を用いて血管透過性亢進の関連があると思われる電気抵抗測定をおこなった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

水素ガスが酸化ストレスを軽減するか検討している。1.細胞培養モデルの確立および水素ガス/ LPS処理 ヒト肺毛細血管内皮細胞(以下、HMVEC-L)をfibronectin- coated transwellのapical底に播種しchamber内に100μLの培養液を充填し培養。同時にbasal chamber内に600μLの培養液を充填する。confluent monolayer形成はTEERを24時間毎に測定し、単層形成したものを各種検討に用いる。LPSは培地に濃度1 μg/mLで混じたものを、apicalに投与する。飽和水素培地は7ppmに調整し、basal chamber内に充填する。対照群は通常培地とする。よって、LPS(-)+水素(-)群、LPS(+)+水素(-)群、LPS(-)+水素(+)群、LPS(+)+水素(+)群にて検討をおこなっている。現在、飽和水素培地を7ppmに調整し、その後の水素飽和環境を維持する事に難渋している。

Strategy for Future Research Activity

繰り返し実験を行い、再現性が得られるように実験手技の練度を上げて、confluent monolayer形成はTEERを24時間毎に測定し、単層形成したものを各種検討に用いる。またLPSは培地に濃度1 μg/mLで混じたものを、apicalに投与する。飽和水素培地は7ppmに調整し、basal chamber内に充填する各段階での不安定性を改善する。

Causes of Carryover

(理由)2020年度中に細胞の継代と保存を実施予定であったが、細胞培養設備の充実を図る必要があり、大型冷凍庫などの必要な機器や備品などの不足により実施できなかったため次年度使用額が生じた。
(使用計画)2021年度以降は、試薬や追加備品購入に使用する予定であり、また成果発表のための学会参加費などにも使用する予定である。