2019 Fiscal Year Research-status Report
廃用性筋萎縮の発生に関わるミトコンドリア・小胞体膜接触領域の機能解明
| Project/Area Number |
19K18501
|
|---|
| Research Institution | The University of Tokushima |
|---|
Principal Investigator |
杉浦 宏祐 徳島大学, 病院, 医員 (60837243)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
|
| Keywords | 廃用性筋萎縮 / ミトコンドリア / 小胞体 / Mitofusin-2 / MAM / 尾部懸垂 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
筋萎縮時の機械ストレス感知機構において、ミトコンドリアの形態・機能制御や小胞体と伝達物質Caイオンなどの運搬機能を担っている、小胞体との近接領域であるMitochondria-associated membrane (MAM)及びそのアンカータンパク質であるMitofusin-2（MFN2）の機能に注目して検討した。
遅筋線維へ優位に分化するSol8筋芽細胞を用い、模擬微小重力モデルである3D-clinorotationに晒すことで微小重力刺激を加えて筋萎縮を誘導して検討した。その結果、タンパク質レベルでMFN2は減少した。続いて、微小重力環境によるMAM形態への影響を捉えるために、MAMを可視化できるProximity Ligation Assay (PLA)法を用いてMAM数を評価した。その結果、微小重力刺激の開始後初期段階からMAM数が減少することを見出した。
さらに廃用性筋萎縮が起こる過程のMFN2及びMAMの機能を解析するため、マウスを10日間尾部懸垂して後肢免荷を行い筋萎縮を誘導した。下腿の前脛骨筋 (TA)、長趾伸筋 (EDL)、腓腹筋 (GA)、およびヒラメ筋 (SOL)を回収し筋重量と及びMAMの形態をPLA法により評価した。
後肢免荷によりSOL及びGAの重量は有意に減少したが、TAとEDLの重量はほとんど変化しなかった。ここで、筋重量が最も減少したSOLと、ほとんど変化しなかったTAにおいて、前述のPLA法にて凍結切片を使用してMAM数の変化を評価した。その結果、通常飼育マウスではSOLに比べTAのMAM数は少なかった。一方でSOLでは筋萎縮を誘導した際にMAMは減少ししたのに対し、TAでは増加した。これは、ミオシン重鎖の組成の違いによってMAMの数が異なることや、筋萎縮誘導時の筋重量変化にMAMの形態が関連することの根拠になり得る結果であった。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
申請計画通りに模擬微小重力刺激や尾部懸垂による後肢免荷により、細胞及びマウスの筋重量やMAMの形態変化を評価できた。結果を下記に記す。
Sol8筋芽細胞を用い、模擬微小重力モデルである3D-clinorotationに晒すことで筋萎縮を誘導した結果、MAM形態はPLA法による評価で時間依存的に減少していくことが明らかとなった。
さらに廃用性筋萎縮が起こる過程のMAMの機能を解析するため、マウスを10日間尾部懸垂により後肢免荷を行い筋萎縮を誘導した。下腿の前脛骨筋 (TA)、長趾伸筋 (EDL)、腓腹筋 (GA)、およびヒラメ筋 (SOL)を回収し筋重量と及びMAMの形態をPLA法により評価した。
後肢免荷によりSOL及びGAの重量は有意に減少したが、TAとEDLの重量はほとんど変化しなかった。ここで、筋重量が最も減少したSOLと、ほとんど変化しなかったTAにおいて、前述のPLA法にて凍結切片を使用してMAM数の変化を評価した。その結果、通常飼育マウスではSOLに比べTAのMAM数は少なかった。一方でSOLでは筋萎縮を誘導した際にMAMは減少したのに対し、TAでは増加した。これは、ミオシン重鎖の組成の違いによってMAMの数が異なることや、筋萎縮誘導時の筋重量変化にMAMの形態が関連することの根拠になり得る結果であった。
|
| Strategy for Future Research Activity |
筋細胞、マウスにおいて、MAMの構成たんぱく質であるMFN2の発現を抑制したうえで実験を行う。
まず、MFN2の発現を抑制した筋細胞やマウスではMAMの形態がどのように変化するのかを検討する。MFN2の発現抑制によってMAMの近接領域が減少すると推察している。
次に、MFN2の発現を抑制した細胞やマウスを3D-Clinorotatorや尾部懸垂を用いてUnloading環境に晒し筋萎縮を誘導する。通常細胞やマウスで筋萎縮を誘導した場合と比べてどのような影響を及ぼすのか検討する。
筋萎縮を助長したり、ミオシン重鎖の組成に影響を及ぼすことを予想している。
|
| Causes of Carryover |
令和元年度は予定よりも学会や研究会への出張回数が少なかったこと、及び消耗品にかかる支出が予定より少なかったため、次年度使用額が生じた。
令和2年度は研究データの管理のためのノートパソコンを購入し、実験用の試薬や実験キット、実験器具などの消耗品、またはサンプル解析の外部委託による支出を予定である。学会や研究会への出張を複数回予定している。
|
