2021 Fiscal Year Research-status Report
２つの細胞系譜で独立に遺伝子操作を行い細胞自律的・非自律的効果を解析する技術開発
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19K22436
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| Research Institution | Kyorin University |
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Principal Investigator |
粟崎 健 杏林大学, 医学部, 教授 (60359669)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
加藤 健太郎 杏林大学, 医学部, 講師 (30733068)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2023-03-31
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| Keywords | 細胞系譜 / ショウジョウバエ / グリア |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、キイロショウジョウバエで開発された既知の遺伝学的解析技術を巧妙に組み合わせることで、「2種類の異なる親細胞に由来する細胞集団で独立に遺伝子操作を行い細胞自律的・非自律的効果を同時に解析する技術」を開発することである。そのために、本研究では、成虫脳ニューロピルグリアを作り出す２つの細胞系譜、「L-EG細胞系譜」と「gcm細胞系譜」それぞれを独立に空間的かつ時間的細胞操作を行う遺伝操作システムを確立する。本年度はL-EG-LexA-DD, L-EG-LexA-GeneSwitch(GS), gcm-GAL4-DD, gcm-GAL4-GS系統を作成し目的とする細胞でリコンビネースを発現誘導する系、さらにUAS-FLP-DD, UAS-FLP-GS, lexA-op-KD1-DD, lexA-op-KD1-GS、Act-KOT-LexAの持つハエ系統を作成することであったが、より実現性の高い方法を考えて、ハエ作成の方法の一部修正を行った。DNAコンストラクションに時間を要したが、L-EG-LexA-DDならびにgcm＋-cell-GAL4-DDのコンストラクションに成功した。
当初は、L-EG-LexA-GeneSwitch(GS)を作成する予定であったが、UAS-FLP-GeneSwitch系統を用いることでこれを代用することとした。また、成虫脳ニューロピルグリアをラベルするために、当初はActin>FOT>GAL4とActin<KOT<LexAによるラベルを予定していたが、より直接的にグリアのみをラベルするために、actinの代わりにグリア特異的なrepoさらに、ニューロピルグリアのサブタイプ特異的な、adult-ALG, Adult-EG特異的なエンハンサーを用いたコンストラクトの作成を行ったが、完成にはいたらなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
昨年度は、「L-EG細胞系譜」と「gcm細胞系譜」を区別するために必要な幼虫期のそれぞれの前駆細胞で特異的に発現するエンハンサーを見つけることができず、そのこともあり、研究計画の一部修正が必要となった。そのために、LexA::P65のC末端にdDHFRのDestabilizing Domain (DD)を結合させた、fusionタンパク質、LexA::P65-DDを発現するベクターならびに、GAL4にDDをを結合させた、fusionタンパク質、GAL4-DDを発現するベクターの構築を行い、その５‘側にそれぞれ、E-LGとgcm+-Cellsのエンハンサー候補を挿入したベクターの構築を計画しその作成を行った。当初、DD配列の組み込みがうまくいかずに、このコンストラクションを完成させることができなかった、その後、合成DNAを利用するこによりコンストラクションの構築を完成させることができた。しかしながら、大幅に時間ロスがあり、計画が大幅に遅れてしまった。
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| Strategy for Future Research Activity |
L-EG-LexA-DD, gcm+-cells-GAL4-DD, LexAop-KD1-DD, UAS-FLP-DD, UAS-FLP-switch, repo>FOT>GAL4, adult-ALG>FOT>GAL4, adult-EG>FOT>GAL4, repo<KOT<GAL4, adult-ALG<KOT<GAL4, adult-EG<KOT<GAL4 の全てのコンストラクションを完成させ、それらを持つハエ系統を作成する。そしてこれらを用いたハエを用いて、RU486(mifespristone)、とTMP(Trimethoprim)この２つの薬剤を時間差で加えることで２つの細胞系譜同時ラベルに最適な条件を見出し、計画したプレジェクトを完遂させる。
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| Causes of Carryover |
DNA構築とハエ系統作成に遅れが生じたため、次年度へ繰り越した。今年度たくさんのハエ系統を作成する必要があり、作成の実験補助のための人件費、受託のための経費ならびに、DNA合成 のための経費に繰り越した予算を使用する予定である。
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