2019 Fiscal Year Research-status Report
Signalosome formation and functions of the immune-checkpoint receptor TIGIT regulated by the height of its ectodomain.
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19K22545
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| Research Institution | Tokyo Medical University |
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Principal Investigator |
横須賀 忠 東京医科大学, 医学部, 主任教授 (10359599)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2022-03-31
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| Keywords | 免疫チェックポイント分子 / 副刺激受容体 / TIGIT / T細胞 / シグナル伝達 / 分子イメージング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
免疫受容体の高さが受容体の細胞表面の分布を決定し、免疫細胞の活性化を担うシグナル伝達の単位「シグナルソーム」を制御するという、構造の違いから生理活性が決定される新たな概念の創出を目的とした。この仮説を証明するための研究対象として、第3のチェックポイント分子T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains（TIGIT）とCD96、またその競合活性化分子DNAM-1の高さの違いに注目し、CD8陽性細胞傷害性T細胞（CTL）とナチュラルキラー（NK）細胞に発現しているこれら3分子がどのように2つの細胞を異なる分子機構で制御しているか、分子の高さの違いをxy軸方向とz軸方向の2つの因子を同時観察する分子イメージングの視点から研究を遂行した。三つの受容体のクラスタリングを可視化するため、高解像度顕微鏡と免疫細胞同士の接着面の詳細な画像取得ができる融合システムを構築し、3分子のカウンターパートであるCD155のGPIアンカーモチーフ型キメラ分子を導入した抗原提示可能な人工平面脂質二重膜（プレイナーメンブレン）を用い、1分子イメージングを行った。その結果、TIGIT、CD96、DNAM-1、T細胞受容体（TCR）のそれぞれ受容体が、各々の分子の高さの違いによって異なったクラスターを形成し、さらに共局在するものとクラスター同士が分画し合う挙動の相違が明らかとなった。以上の結果は、分子の高さを調節することでTIGITを中心としてた複数の活性化及び抑制性受容体とそのリガンドが副刺激受容体ネットワークが存在していることを示唆している。この高さと受容体の局在を制御し、効率的にCTLやNK細胞の活性化を制御することで、より優れた腫瘍効果を持つ第3のチェックポイント分子の候補として、基礎から臨床への基盤研究を進める。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
高解像度顕微鏡とCD155のGPIアンカーモチーフ型キメラ分子を導入した抗原提示可能な人工平面脂質二重膜を用い、TIGITがリガンドであるCD155依存的にクラスターを形成すること、TIGITはTCRマイクロクラスター形成を阻害しないこと、TIGITとTCRはCTLおよびNK細胞のシナプス面にクラスターとして共局在することを明らかにすることができた。TGITIがリガンド依存的に形成するシグナロソームは、サイトカインのような可溶性リガンドでは起こらず、TCRやCD28などこれまで解析してきた全ての受容体とリガンドとのペアに共通する「膜結合型」の特徴を示している。また、CD155との結合を介してTIGITによる活性化受容体DNAM-1との競合も示唆される一方、TIGITとTCRとが共局在することは、TIGITがそれ独自が持つ抑制性シグナルに介してTCRシグナルを制御している可能性を示唆している。またTIGITがリガンドCD155と結合した時の高さがTCR-MHCとほぼ同一であることと一致しており、一方TIGITが結合するリガンドには背の高い分子もあり、これら背の高いリガンドとの相互作用によってTIGITがリガンドの違いによる機能制御を受ける可能性もあり、TIGITを突破口として分子の高さによるシグナルの制御という新たな概念の創出に向けて着実に結果が出ていると考える。一方、本研究対象とする受容体の中で最も背の高いCD96はTIGITやTCRとは異なる局在を呈し、TCRシグナルへの直接的なクロストークを行う可能性は低く、むしろCD155との結合拮抗阻害を介したDNAM-1の抑制がCD96の抑制機構の主なメカニズムであることが予想される。しかし同じ抑制性副刺激受容体であるTIGITとCD96とがCD155結合を介して拮抗する状況も含め、現在の詳細を確認している。
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| Strategy for Future Research Activity |
CD155をリガンドとして結合する受容体CD155、DNAM-1、TIGIT、CD96の野生型および細胞外ドメインの変異体や細胞内シグナルに寄与するモチーフの変異体を作出し、T細胞とNK細胞株に発現させ、標的細胞との混合培養により産生されるinterleukin-2（IL-2）とinterferon γ（IFNγ）産生をELISA法および細胞内サイトカイン染色にて、また下流の活性化シグナル伝達分子のリン酸化をウエスタンブロット、フローサイトメトリーによる細胞内リン酸化タンパク質の染色等にて、T細胞およびNK細胞の活性化応答への寄与を評価する。抗原提示細胞および標的細胞はマウス樹状細胞株DC-1、標的細胞はメラノーマ細胞株B16-F10、胸腺腫細胞株EL-3、形質変異細胞株721.221、バーキットリンパ腫細胞株Rajiを、T細胞は卵白アルブミン（Ovalbumin：OVA）特異的CD8+T細胞株OT91.0、蛾チトクローム特異的CD4陽性T細胞株2D12を、NK細胞株であるNKLを用いる。一方、これらの受容体の1分子イメージング解析のため、CD155のGlycosylphosphatidylinisotol（GPI）アンカー型キメラタンパク質の精製を行い人工平面脂質二重膜の実験系を確立する。またCD155の高さを変化させた変異体GPIキメラタンパク質を作成し、リガンド側でも高さの調節が可能な実験系を構築する。並行してチェックポイント分子としての機能を確認し上記の生理学、生化学、イメージング解析のため、悪性メラノーマ細胞株B16-F10を野生型C57BL/6マウスに皮下投与したNOD-Prkdcscid-IL2Rγnull NSG免疫不全マウスを用いたin vivo評価系の準備を進める。
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| Causes of Carryover |
コロナウイルス感染の影響で必要な試薬が海外から納入できなかったため、当該試薬を用いた実験を次年度に繰り越して行うため。
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