2020 Fiscal Year Research-status Report
Regenerating medicine using multilayered tissues with adipose derived stem cell for COPD
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19K22659
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
新谷 康 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (90572983)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
南 正人 大阪大学, 医学部附属病院, 准教授 (10240847)
大瀬 尚子 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (10570559)
舟木 壮一郎 大阪大学, 医学系研究科, 講師 (50464251)
狩野 孝 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (70528455)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2022-03-31
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| Keywords | 肺再生医療 / 脂肪組織由来間葉系幹細胞 / 細胞シート / 慢性閉塞性肺疾患 / 細胞培養技術 / Layer by Layer法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
呼吸器領域では慢性閉塞性肺疾患（COPD）など非可逆性の慢性進行性の肺疾患が急増しており、臓器移植に代わる根治的な治療法の開発が望まれている。我々は、COPDに対する新たな治療法として、脂肪組織由来間葉系幹細胞（ADSC）を用いた細胞治療に着目し、「ADSC積層シートを外科的に投与する手法を開発し、COPDに対する再生医療にむけ新たな細胞移植法を確立する」ことを目的として、本研究を計画した。
マウスより皮下白色脂肪組織を採取し専用培地でADSCを分取した。フィブロネクチンとゼラチンを交互に積層したLayer by Layer法（LBL法）により細胞同士の接着を誘起し、ADSCで構成される厚みをもった3次元組織体を作成した。また組織培養上清中には、HGFなどの組織再生に関与する成長因子が含有されていることをELISAにて確認した。さらに、エラスターゼ吸入により気腫変化を誘導したCOPDモデルマウスへ、麻酔下に開胸を加え3次元組織体の移植を行い、2週間後に犠牲死させ胸腔内を確認したところ、3次元組織体の委縮を認めたが移植細胞は残存していた。さらに生存細胞数は、2次元培養による細胞シートを重層して移植した場合より細胞生存率が高かった。組織学的評価では、シート移植部位に沿って、気腫性変化の軽減を示唆する所見を得た。また、ADSC分取の過程を短縮するために、マウス由来GFP-ADSC株を用いてLBL法によって3次元組織体を作成し、COPDモデルマウスへ移植を行い、同様の結果を得た。しかし、組織培養上清中のHGFなどの成長因子をELISAにて確認したところ、細胞株の継代数とともに低下するため、ADSCの機能を保つための培養法について再検討が必要であると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
動物実験施設の改修工事のため、マウスの飼育数に制限がもうけられたため、ADSCを分取するためのマウス数を減らさざるを得なかった。現在は、細胞株（マウス由来GFP-ADSC）を用いることで、安定したADSC積層シートを得ることができ、計画していた動物実験を実施することが可能となった。また、COPDモデルマウスへADSC積層シート移植を実施したが、組織学的評価ではシート移植部位の気腫性変化の軽減は限定的であった。ADSCを薬物で前処理してから3次元組織体を作成し、組織再生に関与する成長因子産生を増加させる方法を考案するための、さらなる細胞実験が必要であると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
マウス由来GFP-ADSCを用いて、COPDモデルマウスへの移植を行い、3次元組織体移植による組織学的な気腫性変化の改善を評価することに加え、小動物呼吸機能検査、CT検査、超偏極希ガスMRI検査を実施し、ADSC積層シート移植による生体でのCOPD改善を客観的な呼吸機能に関する指標によって評価を行う予定である。移植したGFP-ADSCは、動物実験施設に設置しているIVIS Imaging Systemで確認することができれば、経時的に生体内で残存変化について観察が可能である。さらに、作成する3次元組織体（積層シート）の厚みを、細胞数で調節し、生着に最適な組織量を明らかにし、さらに積層シートの厚みとCOPD改善効果の関連を解析する予定である。
また、COPDモデルマウスの他、肺全摘モデル、リポポリサッカライドを用いた急性肺損傷モデルマウス、肺門クランプ法を用いた虚血再灌流モデルマウスを用いて、ADSC積層シート移植による病態改善効果を検証する予定である。
ピオグリタゾン(PGZ)を培養中のADSCに添加することで、ADSCの組織再生誘導効果が増強することが他領域で報告されており、本研究でも同様にPGZを用いてADSCの変化、各病態モデルマウスへの治療効果を評価する予定である。
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| Causes of Carryover |
動物実験施設の改修工事のため、マウスの飼育数に制限がもうけられたため、脂肪組織由来間葉系幹細胞（ADSC）を分取するためのマウス数や、ADSCを移植するマウス数を減らさざるを得なかった。本年度は、ADSC細胞株を用いて、当初の計画通りに移植マウス数を増やす予定である。
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