培養細胞上の糖鎖抗原変化と自家細胞移植における免疫応答発生機序の解明

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K22672
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 岩崎 倫政 北海道大学, 医学研究院, 教授 (30322803)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): テルカウィ アラー 北海道大学, 医学研究院, 助教 (00723074) ; 古川 潤一 北海道大学, 医学研究院, 特任准教授 (30374193) ; 宝満 健太郎 北海道大学, 医学研究院, 博士研究員 (40823331)
• Project Period (FY): 2019-06-28 – 2021-03-31
• Keywords: マウスBMSC / 軟骨細胞 / 免疫応答 / 糖鎖

Outline of Annual Research Achievements

2019年度は、１、継代培養前後のマウス軟骨細胞およびマウス骨髄間葉系幹細胞（BMSC）上の糖鎖構造変化が生じることを確認すること、２、継代培養による免疫応答変化を捉えるためのモデルの確立の２点を研究目標とし、研究を実施した。
１、継代培養に伴う糖鎖構造変化の解析
軟骨細胞は哺乳5日目のC57BL/6Nマウスの関節軟骨からコラゲナーゼDで処理して単離した。BMSCは、2週齢の同系マウスの大腿骨と脛骨を採取し、骨髄を長骨から洗い流し、骨片をコラゲナーゼIIで消化、放出された細胞を除去して消化された骨片を培養し、そこから移動して成長する線維芽細胞様細胞をBMSCとして継代培養を行った。各代の細胞上の糖鎖構造をグライコブロッティング法により網羅的に解析し、その構造推定を行った。
２、継代培養による免疫応答変化を捉えるためのモデル
自家および同種細胞をそれぞれ平面培養にて3継代行い、各培養細胞を免疫細胞（マクロファージ）と共培養することにより軟骨細胞およびBMSCの賦活化を評価した。まずはじめにC57BL/6Nマウスの腹腔内マクロファージを単離し、細胞数を2.0×10^5 cellsに調整した。次に各継代数（passage3, 4, 6, 8）のBMSCを2.0×10^5 cellsに同数で調整してマクロファージとtranswellで共培養を行った。培地を回収し、免疫原性の評価としてELISA、TNF-α、IL-6などの産生を計測した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

軟骨細胞における継代培養に伴う糖鎖構造変化が解析により確認された。当初、BMSCは、8週齢のC57BL/6Nマウスの大腿骨と脛骨より採取し、1.0×10^8個の骨髄細胞を培養皿に播種し、48時間後、培地交換により浮遊細胞を除去し、培養皿底面に接着した細胞をBMSCとして得ることを行った。しかし、物理的付着性に基づく方法はBMSCの収率が低く、培養中の造血細胞のコンタミが多いため、BMSCが豊富に存在する骨髄腔と骨の内部界面から採取する方法へ切り替えて現在継続中である。
継代培養による免疫応答変化を捉えるための共培養モデルは、まずはじめに免疫反応の主体となるマクロファージに対して作成し、軟骨細胞とBMSCの両細胞において、継代培養により応答が変化する結果が得られ、概ね良好な達成度といえる。

Strategy for Future Research Activity

2020年度は、BMSCの継代培養による糖鎖構造変化の解析を完遂し、共培養モデルにおいては、マクロファージ以外の免疫細胞（樹状細胞、好中球、リンパ球）との反応を評価することとする。

Causes of Carryover

本年度、実験方法の変更（マウスBMSC採取方法）に伴い予定されていた糖鎖解析が半分しか行われなかった。翌年度の予定に加えて、残り半分の解析が次年度使用額に充当する。