2020 Fiscal Year Annual Research Report
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19K22713
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
岩山 智明 大阪大学, 歯学研究科, 助教 (80757865)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
村上 伸也 大阪大学, 歯学研究科, 教授 (70239490)
山下 元三 大阪大学, 歯学部附属病院, 講師 (90524984)
仲野 和彦 大阪大学, 歯学研究科, 教授 (00379083)
大川 玲奈 大阪大学, 歯学部附属病院, 講師 (80437384)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2021-03-31
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| Keywords | 石灰化過程 / オルガネラ / 歯根膜細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、ゲノム編集技術を用いて改変した細胞や、患者由来細胞を観察対象として、蛍光ラベリング技術を併用し、超解像顕微鏡観察を行うことで、石灰化の初期過程を、特にオルガネラ相互作用を軸に解明する。本年度は以下の結果を得た。
1.昨年度までに作製を完了した各オルガネラマーカーに蛍光タンパク質をノックインするためのドナーベクターを用いて、骨芽細胞中のオルガネラが蛍光タンパク質にて正確に標識されるノックイン細胞を作成した。例えば、内在性のLamp1遺伝子にコードされるタンパク質のC末端にmScarlet蛍光タンパク質を融合し、リソソームがmScarletにて標識される細胞を作製し、シングルセルソーティングによりクローン化し、ストックを完了した。超解像顕微鏡で観察することにより、目的通りの発現局在を確認した。同細胞を石灰化誘導培地にて培養し、超解像顕微鏡で観察したところ、ミトコンドリア-リソソーム相互作用が増加していることが示唆された。
2.ミトコンドリア-リソソーム相互作用に関わる遺伝子群について、昨年度までに作製したノックアウト細胞クローンに加えて、CRISPRa法により内在性の発現を活性化した細胞を作製し、これらの細胞を石灰化誘導培地で培養したところ、2遺伝子については石灰化の程度に変化が見られ、ミトコンドリア-リソソーム相互作用が石灰化初期過程に関与している可能性が強く示唆された。
3.昨年度に引き続き同意を得られた先天性骨系統疾患患者より、抜去した乳歯の提供を受け、歯根膜組織より初代培養細胞を樹立した。
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