2020 Fiscal Year Research-status Report
Development of analysis method of urinary stones based on meteorite scicence and crystal growth strategy
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19K22965
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
丸山 美帆子 大阪大学, 高等共創研究院, 准教授 (20623903)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
古川 善博 東北大学, 理学研究科, 准教授 (00544107)
門馬 綱一 独立行政法人国立科学博物館, 地学研究部, 研究主幹 (30552781)
田中 勇太朗 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 臨床研究医 (70813434)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2022-03-31
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| Keywords | 尿路結石 / 蛍光免疫染色 / シュウ酸カルシウム一水和物 / シュウ酸カルシウム二水和物 / オステオポンチン / カリギュラニュリンA / プロトロンビン / 周期構造 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
2020年度は、昨年度までに確立した結石薄片作製手順にて15個の尿路結石の薄片を作成した。各々に対して偏光顕微鏡観察および顕微FTIRによる分析を組み合わせることで、含有結晶相の同定および結晶組織観察を行った。また、既に免疫染色の条件を確立した3種類のタンパク質（オステオポンチン（OPN）、カリギュラニュリンA（Cal-A）、プロトロンビン（RPTF-1））についてもマルチ染色により可視化した。15例の結石について結晶組織を分類し、それぞれの組織についてタンパク質の分布状況が共通するか否かを詳細に調べた。
結石には、大きく分けて八面体のシュウ酸カルシウム二水和物（COD）、モザイク状シュウ酸カルシウム一水和物（M-COM）、層状シュウ酸カルシウム一水和物（L-COM）の構造が見られる。CODとM-COMは光学顕微鏡で単結晶を判別可能である。L-COMは微細な板状のCOMが球晶状に構造を作った多結晶体であり、光学顕微鏡では単結晶の判別は難しいが、偏光顕微鏡の観察によって結晶の配向性などが確認できた。15個の結石についてこの3つの構造の特徴を比較したところ、共通するタンパク質の分布状況が確認できた。
単結晶を判別可能なCODおよびM-COMについては、OPNとRPTF-1は結晶内部に取り込まれていたが、Cal-Aはどちらの場合にも結晶内部にはほとんど見られず結晶粒界に確認された。またCODの場合には、OPNとRPTF-1は明瞭な周期構造を呈した。一方M-COMについては、結晶内部においてOPNとRPTF-1は強い周期構造を持たず均一に分布するものが多かった。L-COMではそれぞれの微細な板状結晶の内部にOPNとRPTF-1が取り込まれており、かつ周期構造を持つことが確認された。一方、Cal-Aの取り込みは周期的でなく、不規則な間隔で取り込まれていることが確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
15個の結石について観察を行ったところ、今回着眼した3種類のタンパク質（オステオポンチン（OPN）、カリギュラニュリンA（Cal-A）、プロトロンビン（RPTF-1））について共通するタンパク質分布が確認できたことは、予想していた通りであるが非常に良い進捗であった。この結果は,結石形成時にタンパク質が一定の規則に従って取り込まれたことを示しており、これを詳細に解析すれば各々のタンパク質が結石形成過程に及ぼす影響が明らかにできるという手応えを得られた。
現時点では、3種類の構造のうち、CODに関する議論を深く進めている。COD単結晶において、結晶内部に取り込まれたOPNとRPTF-1は明瞭な周期構造を呈し、さらに明確な吸着異方性（OPNは{110}面、RPTF-1は{101}面）を示した。3つのタンパク質は、どれも結晶成長を阻害するという報告がある。しかし、タンパク質の結晶表面への結合力と表面カイネティクスのバランスにより、結晶に取り込まれるものと取り込まれないものに分かれる。観察結果より、Cal-Aの結晶表面への吸着力は相対的に小さいと考えられる。また、RPTF-1が吸着するCODの{101}面は、無機的な結晶合成で一般的に現れる面であるが、OPNが吸着する{110}面は、吸着する有機分子があることで明確に出現する。OPNとRPTF-1が共存する条件で{110}面が現れたことから、特にOPNの結晶成長阻害効果が相対的に強い可能性が示唆された。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、これまでに確認されたタンパク質の分布状況から、結石形成時にタンパク質がどのような影響を及ぼしたのかの機構を明らかにしていく。また、3種類のタンパク質に加えて、シュウ酸カルシウムの結晶成長を加速すると言われているリゾチームなどのタンパク質についても新規に染色できる技術を開発する。性質が異なる複数のタンパク質を同時に染色し、その分布状況を比較することで、より詳細な体内での結石形成機構が見えてくると期待する。
また、これまではシュウ酸カルシウムの結石を中心に観察・分析を行ってきたが、サンプル入手の機会があれば、例えばリン酸カルシウムを主成分とする結石など、他のタイプの結石について薄片の作成、結晶相同定および組織観察、タンパク質の分布状況の可視化を進めていきたい。
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[Presentation] Consideration of Ca-binding protein additive effect based on multi-fluorescent immunostaining of kidney stones2021
Author(s)
〇M. Maruyama, Y. Tanaka, A. Okada, Y. Furukawa, K. Momma, Y. Sugiura, R. Tajiri, K. Taguchi, S. Hamamoto, R. Ando, K. Tsukamoto, M. Yoshimura, T. Yasui, Y. Mori and METEOR Project
Organizer
The 8th Asian Conference on Crystal Growthand Crystal Technology
Int'l Joint Research
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[Presentation] Discovering spatial distribution and differential localization of protein matrix in calcium oxalate stone: A novel method of multifaceted structure analysis2021
Author(s)
Yutaro Tanaka, Atsushi Okada, Mihoko Maruyama, Rie Tagiri, Teruaki Sugino, Rei Unno, Kazumi Taguchi, Shuzo Hamamoto, Ryosuke Ando, Masashi Yoshimura, Yusuke Mori, Kenjiro Kohri, Takahiro Yasui
Organizer
2020 American Urological Association Annual Meeting
Int'l Joint Research
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