Genome-wide CRISPR/Cas9 screening for drug target discovery in neuroblastoma

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K23928
• Research Institution: Saitama Children's Medical Center
• Principal Investigator: 大嶋 宏一 埼玉県立小児医療センター (臨床研究部), 血液腫瘍科, 医長 (60525377)
• Project Period (FY): 2019-08-30 – 2023-03-31
• Keywords: 神経芽腫 / CRISPR / スクリーニング

Outline of Annual Research Achievements

＜目標1:テトラサイクリン誘導Cas9発現神経芽腫細胞株の樹立＞神経芽腫細胞株にpCW-Cas9-Blastレンチウイルスベクターを導入する前に、このシステムが適切に機能するかを急性リンパ性白血病 (ALL) 細胞株 (REH細胞) にて検証を行った。ベクター導入後にシングルセルクローニングを行い、最適なクローンを選択することができたため、スクリーニングが機能するかをALLの治療に用いられる複数薬剤を用いて検証した。その結果、全ての薬剤スクリーニングにて適切と考えられる薬剤抵抗性もしくは感受性に関連する遺伝子及びパスウェイを同定することができ、本システムが適切に機能することを確認できている (Oshima K et al. Nature Cancer. 11, 1113-1127, 2020.)。
＜目標2:神経芽腫細胞株に対するシスプラチン濃度と投与期間の最適化＞神経芽腫治療で重要薬剤の１つであるシスプラチンの投与開始7日後の細胞生存率が20%となる薬剤濃度を決定するのが本目標であるが、ALL細胞株にて複数の至適薬剤濃度の決定は容易に行えることを確認することができたため、同様な計画で神経芽腫細胞株における至適なシスプラチン濃度を決定する過程である。
＜目標3:CRISPRスクリーニングを用いた治療不応性神経芽腫のメカニズムおよび創薬ターゲットの同定＞細胞株の薬剤治療、DNAシーケンス、シーケンスデータ解析、in vitroおよびin vivo実験によるスクリーニングの結果の検証という一連のプラットフォームの確立が重要かつ必須であるが、ALL細胞株を用いたスクリーニングにてプラットフォーム確立を確認することができたため(Oshima K et al. Nature Cancer. 11, 1113-1127, 2020.)、神経芽腫細胞株を用いたスクリーニングの準備も完了した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

昨今の社会情勢のために、長期の在宅勤務をせざるを得ない状況、臨床業務が逼迫している状況が重なり、進捗がやや遅れている。

Strategy for Future Research Activity

＜目標1: テトラサイクリン誘導Cas9発現神経芽腫細胞株の樹立＞ 神経芽腫細胞株にpCW-Cas9-Blastレンチウイルスベクター (Addgene #83481) をレンチウイルス感染にて神経芽腫細胞株に導入し、研究室に設置済みのセルソーターを用いてシングルセルクローニングを行い、最適なクローン (テトラサイクリン非存在下にはCas9を全く発現せず、存在下には強力な発現を誘導する) をWestern blotを用いて選択する。
＜目標2: 上記神経芽腫細胞株に対するシスプラチンの濃度および投与期間の最適化＞神経芽腫治療で最重要薬剤の１つであるシスプラチンの投与開始7日後の細胞生存率が20%となる薬剤濃度を決定する。実験には研究室に設置されたプレートリーダーを用いて、MTTアッセイを行う。
＜目標3: CRISPRスクリーニングを用いた治療不応性神経芽腫のメカニズムおよび創薬ターゲットの同定＞目標1と2を本年度前半に達成した後に、細胞株の薬剤治療、DNAシーケンスおよびシーケンスデータ解析を実施する。その後、in vitroおよびin vivo実験によるスクリーニングの結果の検証を行う。これと同時に、これまで既に報告されている神経芽腫細胞株を用いたスクリーニングのゲノムデータは公表されているため、創薬ターゲットの同定のためにそれらのデータも使用する。

Causes of Carryover

当該年度の実験は、これまで購入済みの試薬等で実施可能であり、実験が遅延していたこともあり、新たに試薬などの購入は不要であったが、次年度については新たな実験を計画しているため、次年度使用額が生じた。