リン酸化キナーゼのプロテオーム解析による肺腺癌の治療標的分子の同定

2008 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20390363
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 桜田 晃 Tohoku University, 病院, 助教 (60360872)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 遠藤 千顕 東北大学, 病院, 講師 (80333813)
• Keywords: 肺癌 / EGFR遺伝子 / キナーゼ / プロテオーム / リン酸化

Research Abstract

EGFR下流の情報伝達経路が、EGFR阻害剤を加えることによって、どの程度の時間スケールで変化するのかを知るため、EGFR阻害剤による処理後、異なる時間で細胞を回収し、ウェスタンプロットで、EGFRおよびその下流の蛋白のリン酸化状態を確認した。処理後5分、10分、30分、1時間、2時間、4時間、8時間、24時間で細胞を回収した。EGFR蛋白のリン酸化チロシン部位Y1068、Y1173は、処理後5分でほぼ完全にリン酸化が抑制されていた。一方、Y1045は24時間経過した時点でもリン酸化が保持されていた。また、下流に位置するとされるErkのリン酸化は5分の時点でほぼ完全にリン酸化が抑制されていたが、一方で、Aktは24時間の時点まで、リン酸化が保たれていた。以上の結果より、EGFR蛋白内部においても、異なる位置にあるチロシンは、リン酸化の調節も異なっている可能性があること、下流の蛋白のリン酸化の調節が一律になされているわけではないことを示唆していると考えられた。
EGFR遺伝子に変異を有する細胞を用いて、細胞内に存在するリン酸キナーゼの同定を試みた。細胞を1×10^8個まで増殖させたものを3群用意し、それぞれ、無処理、EGFR阻害剤処理、EGFR阻害剤処理+EGF添加、の各条件として細胞を回収した。蛋白を抽出し、トリプシン処理によりペプチドに分解した。3群それぞれから得られたペプチドを異なる標識試薬で処理した後、抗チロシン抗体を用いて免疫沈降処理を行い、チロシンを含むペプチドを回収した。これらをマススペクトロメトリーを用いて解析した。現在、ペプチドの信号がノイズと分離可能で十分信頼できる質であるかどうかを解析中である。

Research Products

• [Journal Article] Predictive biomarkers for EGFR therapy (2009)
  • Author(s): Sakurada A, Tsao MS
  • Journal Title: IDrugs 12 Pages: 34-38
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The methylation status of FBXW7 beta-form correlates with histological subtype in human thymoma (2008)
  • Author(s): Gu Z, Mitsui H, lnomata K, Honda M, Endo C, Sakurada A, Sato M, Okada Y, Kondo T, Horii A
  • Journal Title: Biochem Biophys Res Commun 377 Pages: 685-688
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Role of KRAS and EGFR as biomarkers of response to erlotinib in National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group Study BR. 21 (2008)
  • Author(s): Zhu CQ, da Cunha Santos G, Ding K, Sakurada A, Cutz JC, Liu N, Zhang T, Marrano P, Whitehead M, Squire JA, Kamel-Reid S, Seymour L, Shepherd FA, Tsao MS
  • Journal Title: J Clin Oncol 26 Pages: 4268-4275
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Phase II study of erlotinib in recurrent or metastatic endometrial cancer : NCIC IND-148 (2008)
  • Author(s): Oza AM, Eisenhauer EA, Elit L, Cutz JC, Sakurada A, Tsao MS, Hoskins PJ, Biagi J, Ghatage P, Mazurka J, Provencher D, Dore N, Dancey J, Fyles A
  • Journal Title: J Clin Oncol 26 Pages: 4319-4325
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Tissue heterogeneity of EGFR mutation in lung adenocarcinoma (2008)
  • Author(s): Sakurada A, Lara-Guerra H, Liu N, Shepherd FA, Tsao MS
  • Journal Title: J Thorac Oncol 3 Pages: 527-529
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] siRNA targeting against EGFR, a promising candidate for a novel therapeutic application to lung adenocarcinoma (2008)
  • Author(s): Yamanaka S, Gu Z, Sato M, Fujisaki R, Inomata K, Sakurada A, Inoue A, Nukiwa, T, Kondo T, Horii A
  • Journal Title: Pathobiologyl 75 Pages: 2-8
  • Peer Reviewed