2008 Fiscal Year Annual Research Report
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20657028
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Exploratory Research
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
水島 徹 Kumamoto University, 大学院・医学薬学研究部, 教授 (00264060)
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| Keywords | DNA複製 / ORC / Cdc6p |
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| Research Abstract |
遺伝学的解析から、真核生物での複製開始反応において、複製開始点に常に結合しているORCに、まずCdc6pが結合し、次にMCMが結合し、pre-RCと呼ばれる複製前複合体がG1期に形成されることがその第一段階と考えられている。我々は既に複製開始点上で、ORCとCdc6pの複合体を試験管内で形成させることに成功しているので、この複合体に、MCMを結合させ、pre-RCを試験管内で再構成することを試みた。MCMは複数のサブユニットから成るタンパク質であるので、それらすべてのサブユニットを昆虫細胞で同時に多量発現し精製する。単にMCMを加えただけでは、pre-RCが形成されなかったので、まずG1期の核粗抽出液からpre-RCを再構成し、その後その粗抽出液から、pre-RC形成に必要な未知因子を精製するという戦略をとった。pre-RCが確かに形成されているという証明は、フットプリント法により行った。その結果、pre-RCの再構成に成功した。
酵母では、DNA複製に必要な遺伝子が、変異株の解析から数多く同定されている。また遺伝学的解析から、それらの遺伝子が複製反応においてどのような順番でどのように働くかも、ある程度予測されている。そこで、これらの因子(サイクリン、サイクリン依存性蛋白質リン酸化酵素、Cdc45p,RPA,RFC,DNA polymerase a,dなど)を細胞内で多量発現し、精製した。
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Research Products
(3 results)
