レンチウイルスベクターによる視床-大脳新皮質相互結合の定量的解析

2009 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20700315
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 日置 寛之 Kyoto University, 医学研究科, 助教 (00402850)
• Keywords: レンチウイルス / 経シナプストレーサー / Tet-Offシステム / 共発現 / 中枢神経系 / 視床 / 大脳皮質 / 局所回路

Research Abstract

本研究の最終目的は、逆行性経シナプストレーサー(Tetanus Toxin C fragment, TTC)もしくは順行性経シナプストレーサー(Wheat germ agglutinin, WGA)を発現するウイルスベクターを開発し、その後成体ラットを用いて視床・大脳新皮質局所神経回路の定量的解析を目指すものである。昨年度は、神経細胞特異的かつ高発現を可能にするレンチウイルスの開発を行った(Hioki et al., 2009)。神経細胞特異的プロモーターであるSYNプロモーター下でテトラサイクリン調節性トランス活性化因子(tTA:Tet-Off)を発現するウイルス、Tet応答性プロモーター下でGFPを発現するウイルスを二重感染させるシステムを利用することで、目的遺伝子の発現量が従来のシステムに比し、40倍程度まで増強した。そこで本年度は、Tet-Offシステムを用い(a) TTCもしくはWGAとレポータータンパク(蛍光タンパク)を共発現するレンチウイルスの開発、(b) TTCもしくはWGAの検出法の最適化を試みた。
(a) Tet応答性・双方向性プロモーター(TREB)を用いて実験を始めたが、2種の遺伝子発現量が感染細胞によって大きくばらつくといった問題に直面した。そこで共発現に最適なシステムの開発を行った結果、手足口病ウイルス由来の2Aシグナルを利用すればよいことが分かった。現在は2Aシグナルを用いたレンチウイルスの作成に着手したところである。
(b) 『抗体の作成・精製』『PAP法とTSA法を組み合わせた高感度増感法の開発』を行った結果、TTCについてはシナプスを逆行性に超えたタンパクの検出に成功した。ただし、染色毎にばらつきが生じるため、更なる改良が必要と思われる。WGAについては現時点でシナプスを超えた像を検出できていない。

Research Products

• [Journal Article] Co-expression of VGLUT1 and VGLUT2 in trigeminothalamic projection neurons in the principal sensory trigeminal nucleus. (2010)
  • Author(s): Ge S-N, Ma Y-F, Hioki H, Wei Y-Y, Kaneko T, Mizuno N, Li J-L, Gao G-D.
  • Journal Title: The Journal of Comparative Neurology
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Ischemia-induced neurogenesis of neocortical layer 1 progenitor cells. (2010)
  • Author(s): Ohira K, Furuta T, Hioki H, Nakamura KC, Kuramoto E, Tanaka Yasuyo, Funatsu N, Shimizu K, Oishi T, Hayashi M, Miyakawa T, Kaneko T, Nakamura S.
  • Journal Title: Nature Neuroscience 13 Pages: 173-179
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Vesicular Glutamate Transporter 3-Expressing Nonserotonergic Projection Neurons Constitute a Subregion in the Rat Midbrain Raphe Nuclei. (2010)
  • Author(s): Hioki H, Nakamura H, Ma Y-F, Konno M, Hayakawa T, Nakamura KC, Fujiyama F, Kaneko T.
  • Journal Title: The Journal of Comparative Neurology 518 Pages: 668-686
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Two types of thalamocortical projections from the motor thalamic nuclei of the rat : a single neuron tracing study using viral vectors. (2009)
  • Author(s): Kuramoto E, Furuta T, Nakamura KC, Unzai T, Hioki H, Kaneko T.
  • Journal Title: Cerebal Cortex 9 Pages: 2065-2077
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Inhibitory and excitatory subtypes of cochlear nucleus neurons are defined by distinct bHLH transcription factors, Ptfla and Atoh1. (2009)
  • Author(s): Fujiyama T, Yamada M, Terao M, Terashima T, Hioki H, Inoue YU, Inoue T, Masuyama N, Obata K, Yanagawa Y, Kawaguchi Y, Nabeshima Y, Hoshino M.
  • Journal Title: Development 136 Pages: 2049-2058
  • Peer Reviewed
• [Presentation] パルブアルブミン発現皮質神経細胞への抑制性入力は細胞体周辺部に多い (2010)
  • Author(s): 亀田浩司, 日置寛之, 田中康代, 田中琢真, 薗村貴弘, 藤山文乃, 中村公一, 金子武嗣
  • Organizer: 第115回日本解剖学会
  • Place of Presentation: 盛岡
  • Year and Date: 2010-03-29
• [Presentation] 組換えウイルストレーサーによる単一細胞標識法を用いて、ラットの視床後核群ニューロンの軸索分岐を解析する (2010)
  • Author(s): 大野幸, 倉本恵梨子, 古田貴寛, 日置寛之, 椙山加綱, 金子武嗣
  • Organizer: 第115回日本解剖学会
  • Place of Presentation: 盛岡
  • Year and Date: 2010-03-29
• [Presentation] 後外側核ニューロンの視床皮質投射:ウイルスベクターを用いた単一ニューロンの形態学的解析 (2010)
  • Author(s): 中村悠, 日置寛之, 中村公一, 古田貴寛, 金子武嗣
  • Organizer: 第115回日本解剖学会
  • Place of Presentation: 盛岡
  • Year and Date: 2010-03-29
• [Presentation] VGLUT3発現・非セロトニン作動性神経細胞は投射型ニューロンであり、ラット背側縫線核において亜核を構成する (2010)
  • Author(s): 日置寛之, 中村悠, 馬雲飛, 今野美知輝, 早川隆, 中村公一, 藤山文乃, 金子武嗣
  • Organizer: 第115回日本解剖学会
  • Place of Presentation: 盛岡
  • Year and Date: 2010-03-29
• [Presentation] ラット視床内側腹側核ニューロンの軸索投射を単一ニューロンレベルで解析する (2010)
  • Author(s): 倉本恵梨子, 藤山文乃, 古田貴寛, 雲財知, 日置寛之, 金子武嗣
  • Place of Presentation: 盛岡
  • Year and Date: 2010-03-28
• [Presentation] Parvalbumin-expressing cortical interneurons receive GABAergic inputs preferentially on the proximal dendrites. (2010)
  • Author(s): Kameda H, Hioki H, Tanaka Yasuyo, Tanaka T, Sonomura T, Fujiyama F, Nakamura KC, Kaneko T
  • Organizer: The 56th NIBB Conference "Neocortical Organization"
  • Place of Presentation: 岡崎
  • Year and Date: 2010-03-13
• [Presentation] Efficient visualization of central neurons with lentiviral vectors expressing red fluorescent protein. (2010)
  • Author(s): Okamoto S, Hioki H, Konno M, Kameda H, Kaneko T
  • Organizer: The 56th NIBB Conference "Neocortical Organization"
  • Place of Presentation: 岡崎
  • Year and Date: 2010-03-13
• [Presentation] Search for molecular markers of layer VI corticothalamic neurons in the rat neocortex. (2010)
  • Author(s): Konno M, Hioki H, Nakamura KC, Kaneko T
  • Organizer: The 56th NIBB Conference "Neocortical Organization"
  • Place of Presentation: 岡崎
  • Year and Date: 2010-03-13
• [Presentation] ラット中枢神経系 神経回路網の解析:ウイルスベクター・遺伝子改変動物を用いて (2010)
  • Author(s): 日置寛之
  • Organizer: 第3回ラットリソースリサーチ研究会
  • Place of Presentation: 京都
  • Year and Date: 2010-01-29
• [Presentation] ラット運動性視床核における大脳基底核および小脳核からの軸索終末の相補的分布 (2009)
  • Author(s): 倉本恵梨子、藤山文乃、中村公一、日置寛之、金子武嗣
  • Organizer: 第85回日本解剖学会 近畿支部学術集会
  • Place of Presentation: 奈良
  • Year and Date: 2009-11-28
• [Presentation] 成熟期大脳皮質に存在する神経前駆細胞 (2009)
  • Author(s): 大平耕司, 古田貴寛, 日置寛之, 中村公一, 倉本恵梨子, 船津宣雄, 清水慶子, 大石高生, 林基治, 宮川剛, 金子武嗣, 中村俊
  • Organizer: 第32回日本神経科学学会
  • Place of Presentation: 名古屋
  • Year and Date: 2009-09-17
• [Presentation] ラット体性感覚野におけるconnexin36発現神経細胞の化学的解析 (2009)
  • Author(s): 馬雲飛, 日置寛之, 中村公一, 中村悠, 潘世秀, 古田貴寛, 金子武嗣
  • Organizer: 第32回日本神経科学学会
  • Place of Presentation: 名古屋
  • Year and Date: 2009-09-17
• [Presentation] 大脳皮質興奮性細胞から皮質視床投射細胞への皮質内入力の定量 (2009)
  • Author(s): 田中康裕, 田中康代, 今野美知輝, 藤山文乃, 岡本ー古田敬子, 薗村貴弘, 亀田浩司, 日置寛之, 古田貴寛, 中村公一, 金子武嗣
  • Organizer: 第32回日本神経科学学会
  • Place of Presentation: 名古屋
  • Year and Date: 2009-09-17
• [Presentation] 中脳辺縁皮質系ドパミン細胞の投射様式を解析する (2009)
  • Author(s): 松田和郎, 古田貴寛, 中村公一, 日置寛之, 藤山文乃, 安原治, 金子武嗣
  • Organizer: 第32回日本神経科学学会
  • Place of Presentation: 名古屋
  • Year and Date: 2009-09-17
• [Presentation] ラット大脳皮質第VI層の皮質一視床投射細胞に対する特異的マーカーを探索する (2009)
  • Author(s): 今野美知輝、日置寛之、中村公一、金子武嗣
  • Organizer: 第32回日本神経科学学会
  • Place of Presentation: 名古屋
  • Year and Date: 2009-09-17
• [Presentation] Tet-Offシステム搭載レンチウイルスによる、神経細胞特異的共発現ベクターの開発 (2009)
  • Author(s): 日置寛之、岡本慎一郎、今野美知輝、亀田浩司、倉本恵梨子、金子武嗣
  • Organizer: 第32回日本神経科学学会
  • Place of Presentation: 名古屋
  • Year and Date: 2009-09-17
• [Presentation] 神経発生におけるRho標的分子mDiaの役割 (2009)
  • Author(s): 篠原亮太, 上條博史, 日置寛之, 金子武嗣, 石崎敏理, 古屋敷智之, 成宮周
  • Organizer: 第32回日本神経科学学会
  • Place of Presentation: 名古屋
  • Year and Date: 2009-09-16
• [Presentation] ラット運動性視床核における大脳基底核および小脳核からの軸索終末の分布 (2009)
  • Author(s): 倉本恵梨子, 藤山文乃, 日置寛之, 金子武嗣
  • Organizer: 第32回日本神経科学学会
  • Place of Presentation: 名古屋
  • Year and Date: 2009-09-16
• [Presentation] RFP発現レンチウイルスによる中枢神経細胞の可視化 (2009)
  • Author(s): 岡本慎一郎, 日置寛之, 今野美知輝, 亀田浩司, 金子武嗣
  • Organizer: 第32回日本神経科学学会
  • Place of Presentation: 名古屋
  • Year and Date: 2009-09-16
• [Presentation] BAC遺伝子改変マウスを用いた、パルブアルブミン発現皮質神経細胞への興奮性・抑制性入力の定量的解析 (2009)
  • Author(s): 亀田浩司, 薗村貴弘, 田中康代, 中村公一, 藤山文乃, 日置寛之, 金子武嗣
  • Organizer: 第32回日本神経科学学会
  • Place of Presentation: 名古屋
  • Year and Date: 2009-01-06
• [Remarks]
  • URL: http://www.mbs.med.kyoto-u.ac.jp/default.html