2021 Fiscal Year Annual Research Report
Establishment of research base for lipid chemical biology
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20H00405
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
松森 信明 九州大学, 理学研究院, 教授 (50314357)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
老木 成稔 福井大学, 高エネルギー医学研究センター, 特命教授 (10185176)
岩本 真幸 福井大学, 学術研究院医学系部門, 教授 (40452122)
木下 祥尚 九州大学, 理学研究院, 助教 (40529517)
神田 大輔 九州大学, 生体防御医学研究所, 教授 (80186618)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 脂質 / 膜タンパク質 / ケミカルバイオロジー / KcsA / バクテリオロドプシン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
「生物はなぜ多様な脂質を有するのか?」という根源的な問いが解明されていない。この答えの一つとして、膜タンパク質の構造や機能を制御するために多様な脂質が必要である、との仮説が成り立つ。一方で、脂質-膜タンパク質間相互作用解析の方法論が欠如しているため、この分野の研究が進まない現状がある。そこで本研究では、松森らが脂質膜研究で開発した分析手法を集約化することで脂質-膜タンパク質間相互作用解析のプラットフォームを構築し、脂質機能および脂質多様性の解明を目指す。
令和3年度には以下の研究を行い、成果を挙げることができた。
我々はすでに表面プラズモン共鳴(SPR)センサーチップの金基盤表面を自己組織化単分子膜(SAM)で修飾することで膜タンパク質を高密度に固定化することに成功し、膜タンパク質に特異的に結合する脂質の分析を可能にした。昨年度までに放線菌由来のカリウムチャネルKcsAに本手法を適用し、カルジオリピンが特異的に結合することを見出している。令和3年度には、分担者の老木、岩本教授らと共同で、カルジオリピンがKcsAのチャネル活性をアロステリックに亢進させることを発見した。さらにミューテーション実験からカルジオリピンの結合部位を特定するとともに、分子動力学シミュレーションを行い、このアロステリック効果のメカニズムを明らかにした。
一方、SPRを用いた相互作用解析方法では特異的脂質を見つけるために種々の脂質を分析する必要がある。この欠点を補うために、金ナノ粒子をSAMで修飾し、これに膜タンパク質を固定化することで、膜タンパク質特異的脂質を簡便に取得する手法を発案した。すでにバクテリオロドプシン(bR)を用いて本アイデアの検証を行い、方法論としてほぼ完成させた。さらにこの方法を用いて、bRの特異的脂質であるS-TGA-1以外に、S-TeGA-1もbRに強く結合することを見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
カリウムチャネルKcsAと脂質の相互作用に関して、カルジオリピンが脂質膜の外葉に存在するだけでチャネル活性が亢進することを明らかにした。これまでKcsAが内葉の脂質と相互作用することは報告されていたが、外葉の特異的脂質と相互作用しチャネル活性を亢進するという新発見に至った。さらにKcsAに変異を導入することで、カルジオリピンの相互作用部位に関する知見を得ることができた。この結果をもとに分子動力学シミュレーションを行い、カルジオリピンの作用機構まで迫ることができた。このように、KcsAの特異的脂質の同定、その機能解析、さらに計算による裏付け、までの一連の研究が完成し、大きなインパクトのある成果となった。
また金ナノ粒子を用いた膜タンパク質特異的脂質の取得に関しても、方法論としてほぼ完成させることができ、特異的脂質の同定が簡便化が可能となった。また実際にこの方法によりバクテリオロドプシンに対する新たな特異的脂質を発見することができた。本手法の確立は本申請の成否を分けることから、申請課題達成の目途が立ったと言える。さらに本手法は膜タンパク質に結合する薬剤の探索にも応用できる。実際にすでにこの検討を開始していることから、本方法論は大きな波及効果が期待できる。
一方で、特異的脂質とタンパク質の共結晶作成に関してはコロナの影響もあり、思うように進捗しなかった。後述のように、クライオ電子顕微鏡の適用も含めてこの検討を加速する必要がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
金ナノ粒子を用いた方法論をカリウムチャネルKcsAやアクアポリンなどその他の膜タンパク質に適用していく。上述のようにKcsAではカルジオリピンが特異的脂質であることをすでに明らかにしたが、これは購入した人工的なカルジオリピンを用いた検討であり、アシル鎖の長さや二重結合の数によって親和性が変わる可能性がある。そこで、金ナノ粒子にKcsAを固定化し、KcsA生産菌である放線菌の脂質膜抽出液を作用させ、放線菌膜で実際にKcsAと相互作用しているカルジオリピンの探索を行う。また本手法を用いた膜タンパク質結合薬剤の探索も本格化する。
また特異的脂質と膜タンパク質の共結晶を作成し、複合体構造のX線結晶構造解析を行う。膜タンパク質を膜環境に近い状態で結晶化させる手法として、バイセル法などが知られている。ここに特異的脂質を加えることで、特異的脂質と膜タンパク質の共結晶を作成していく。具体的には、バクテリオロドプシンの特異的脂質であるS-TGA-1存在下でバクテリオロドプシンのバイセル結晶化を行い、バクテリオロドプシンとS-TGA-1の相互作用様式および三量体形成機構を詳細に解析する。一方で、近年のクライオ電子顕微鏡の発展により、脂質と膜タンパク質の相互作用を解析できる可能性が高まっている。実際、分担者の神田教授の研究室でこの測定が可能となっている。そこで、X線結晶構造解析に加えて、クライオ電子顕微鏡での検討も並行して行う。
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Research Products
(15 results)
