2021 Fiscal Year Annual Research Report
新規シグナル伝達系・NELL-Roboシグナルの骨形成における作用機序の解明
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20H02948
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
新美 友章 名古屋大学, 生命農学研究科, 講師 (30377791)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
水谷 公彦 京都大学, 農学研究科, 助教 (40314281)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 骨芽細胞 / タンパク質 / FRET解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
乳児期において頭頂骨のつなぎ目が早期に癒合する頭蓋骨縫合早期癒合症（狭頭症）の原因遺伝子のひとつとして知られるNELL1は、頭蓋顔面の骨格形成に関わる分泌タンパク質をコードしており、その骨形成作用に基づいた骨再生治療への応用が試みられている。しかし、NELL1の骨形成作用の分子基盤、特に細胞表面受容体と下流のシグナル伝達機構は不明な点が多く、臨床応用する際のボトルネックとなっている。本研究では、我々が発見したNELL1 の新奇受容体Roundabout2 (Robo2)と下流のシグナル伝達経路（NELL1-Robo2シグナル）の骨形成における役割を解明することにより、NELL1を利用した骨再生治療の基盤研究を行うことを目的とした。
Robo2は、pH 7付近の生理的条件下においてはNELL1の結合部位がマスクされているためNELL1が結合できないが、pH 5~6付近の酸性条件下では、Robo2の細胞外領域のコンフォメーション変化により、NELL1が結合できるようになると考えられる。本研究計画では酸性条件下におけるRobo2のコンフォメーション変化の分子機構を解明することを初期の目標とした。
昨年度は、組換えタンパク質を用いた結合実験、蛍光共鳴エネルギー移動：Fluorescence resonance energy transfer (FRET) の変化を指標にしたRobo2 の構造解析およびサイズ排除クロマトグラフィー解析を行い、酸性条件におけるRobo2の細胞外領域の推定構造と分子機構の解明に成功した。Robo2の新奇受容体としてNELL1が働く分子基盤の一端が解明されたことで本研究成果は重要である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
NELL1の新奇受容体として同定したRobo2の、組換えタンパク質を用いた結合実験を行い、酸性条件におけるRobo2の細胞外領域のコンフォメーション変化の分子機構を解明した。また、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）解析およびサイズ排除クロマトグラフィー解析により、酸性条件下におけるRobo2の推定構造を得ることに成功し、NELL1-Robo2シグナルが働く分子基盤の一端を解明した。
Robo2遺伝子の選択的スプライシング産物の中で、NELL1への結合活性が高いものを発見した。FRET解析とサイズ排除クロマトグラフィー解析によって、その分子機構を解析したところ、酸性条件とは異なる機構でNELL1への結合活性が高まっていることを明らかにした。NELL1への結合活性が高い選択的スプライシング産物の存在比を様々な組織で調べたところ、ほとんどの組織において発現量はわずかであったが、頭蓋冠においては通常タイプのものと同程度の発現が見られた。
酸性条件において、NELL1-Robo2がどのような役割を果たしているかを解明するために、前駆骨芽細胞の酸性条件培養法を確立し、酸性条件におけるNELL1-Robo2シグナルの解明に着手した。
以上のように研究の進捗状況はおおむね順調である。
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| Strategy for Future Research Activity |
NELL1-Robo2シグナルの役割の解明を目指し、前駆骨芽細胞の酸性条件培養にNELL1タンパク質を添加して、その効果を解析する。前駆骨芽細胞はRobo2を発現しているが、その発現量はあまり高くないためRobo2の安定発現株を取得して使用する。
昨年度の研究で発見したNELL1への結合活性が高いRobo2の選択的スプライシング産物は、中性から弱酸性領域でもNELL1に結合することが可能なので、酸性条件培養のみならず、通常の生理的条件での培養での実験が一部可能になる。従って、選択的スプライシング産物の安定発現株を取得する。
Robo2への結合はNELL1のみでなくNELL2でも可能なことを確認している。従って、NELL1-Robo2シグナルの解明のみならず、NELL2-Robo2シグナルを解明する実験系の構築を模索する。
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