2020 Fiscal Year Annual Research Report
Production of marker-free transplastomic plants using complementation of the psbA-deletion mutant
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20H02961
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| Research Institution | Kyoto Sangyo University |
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Principal Investigator |
寺地 徹 京都産業大学, 生命科学部, 教授 (90202192)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山岸 博 京都産業大学, 生命科学部, 教授 (10210345)
木村 成介 京都産業大学, 生命科学部, 教授 (40339122)
桶川 友季 京都産業大学, 植物科学研究センター, 研究員 (10582439)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 葉緑体形質転換 / psbA / 光化学系II / タバコ / アルビノ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
高等植物で葉緑体の組換え体を得るためには、通常、組換え体を選抜するマーカー遺伝子を用いる。マーカー遺伝子の多くは細菌由来の抗生物質耐性遺伝子であり、葉緑体の組換えを野菜などの作物へ応用する際には、耐性遺伝子に対して消費者が良いイメージを持たず、作出された組換え作物に不安を抱くことが懸念される。そこで近年、耐性遺伝子を使わずに組換え体を選抜する「マーカーフリー」な組換え方法の開発が求められている。
当研究室では、栽培タバコ（Nicotiana tabacum cv. SR1）を用いて葉緑体の組換え系統を多数作出してきた。その中には、自律複製能力のある葉緑体DNA断片を持つプラスミドを葉緑体に導入して得た系統があるが、#3-2と呼ぶ系統では、導入したプラスミドよりはるかに大きなプラスミドが保持されていることがわかっている。また、この系統の自殖第2代は、若い葉は緑色で生えてくるが、葉が発達して古くなるにつれ白色化してアルビノになる特徴的な表現型を示す。このアルビノタバコを次世代シークエンシングにより解析したところ、葉緑体ゲノム上にあるpsbAのコード領域が欠失していることが明らかとなった。またこの欠失は、#3-2の葉緑体に存在するプラスミドと葉緑体ゲノム間でイレギュラーな相同組換えが生じた結果、プラスミド側にpsbAが移行した後、プラスミドが植物から脱落したことで生じたと推察された。
本研究は、このアルビノタバコを材料に、psbAを相補することで白色の葉から緑色の形質転換体を作出することが可能か、またこの現象を利用して抗生物質を用いず組換え体を選抜できないかを検討することを目的とした。そのため初年度は、psbAを欠失しているアルビノタバコ（#3-2 T2）の特徴づけ、ならびにアルビノタバコの葉を用いた葉緑体形質転換に関する基礎実験を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究ではまず、アルビノタバコの葉を用いた葉緑体形質転換実験に必要とされる、プラスミドベクターの構築を進めた。本研究で使用するpsbAの遺伝子領域は、大腸菌の系においてunclonableな領域として以前より知られている。すなわち、psbA遺伝子のプロモーターは、葉緑体のプロモーターであるにもかかわらず、大腸菌の細胞中でも機能することが報告されており、psbA遺伝子のコード領域から作られるD1タンパク質は、大腸菌の生育を妨げるとされる。事実、我々の当初の実験でも、プロモーターを含むpsbA遺伝子の全長は、大腸菌でクローニングできなかった。そこで本研究では、ホストとなる大腸菌の菌株を、通常の実験に用いられるDH5α株からHST16CR株に変更した。その結果、プロモーターを含めたpsbA遺伝子の全長を大腸菌でクローニングすることに初めて成功した。また、HST16CR株からプラスミドDNAを調製できるようになったので、このDNAを鋳型にインバースPCRを行うことで、プラスミド内のpsbA遺伝子のコード領域に、任意のSNPを導入することにも成功した。これらの成果により、psbAの相補によるアルビノタバコの形質転換実験にむけた準備が整った。
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| Strategy for Future Research Activity |
すでに構築を終えたpsbA遺伝子のコード領域全長を持つプラスミドを出発材料に、相同組換えで遺伝子を葉緑体ゲノムに導入することが可能な、通常型の葉緑体形質転換ベクターにpsbA遺伝子をクローニングする。また、自律複製型の葉緑体形質転換ベクター（プラスミドに葉緑体内で自律複製する能力を付与する葉緑体DNA断片を持つ）にもpsbA遺伝子をクローニングする。これらのプラスミドの構築を終えたら、プラスミドDNAを大腸菌を用いて大量調製する。その後、当初の予定どおり、ボンバードメント法により、各プラスミドDNAをアルビノタバコの葉に導入する。
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