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2021 Fiscal Year Annual Research Report

染色体複製サイクル再構成系の高度化で探るゲノム機能

Research Project

Project/Area Number 20H03238
Research InstitutionRikkyo University

Principal Investigator

末次 正幸  立教大学, 理学部, 教授 (00363341)

Project Period (FY) 2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords染色体 / 複製 / 転写 / 翻訳 / 試験管内再構成
Outline of Annual Research Achievements

我々が独自に開発した大腸菌染色体複製のサイクルを再構成した複製サイクル再構成系では、ゲノムサイズの環状DNA分子の指数的な増幅が達成される。大腸菌をモデルとした研究では、複製系以外にも転写・翻訳、DNA修復、組換え、複製周期制御など、ゲノムにまつわる多くのシステムが試験管内再構成されている。そこで本研究ではこれらシステムを複製サイクル再構成系に融合し、ゲノム動態の統合的な再現を目指した。またシステムだけでなくゲノム(染色体)自体を試験管内に取り出しての検討も進めた。
染色体複製サイクル再構成系に転写再構成系を融合し、同じミニ染色体上で、複製反応、転写反応が相互に及ぼす影響について解析を進めた。その結果、同一鋳型DNA上での転写が複製反応に阻害的であるという現象を見出した。そこで転写と複製の衝突を回避するためのいくつかの機構について試験管内再構成系に融合して検討し、転写と複製が同一の反応系において効率よく進行する条件を見出した。
また、染色体複製サイクル再構成系にDNAメチル化を解した複製開始制御機構についても融合することに成功した。その中で興味深い現象が見出されたので、更なる解析を進めている。
さらに、染色体自体を試験管内に取り出して生化学的解析に用いる実験に対しては、染色体を大腸菌からスーパーコイルDNAとして壊さずに精製する技術を構築した。通常の大腸菌ゲノムはサイズが大きく壊さずに精製することが難しいが、我々は染色体を細胞内で分断する技術を独自に開発し、1Mbや2Mbの分断染色体を精製し、さらにその分断染色体について、染色体複製サイクル再構成系を用いて環状スーパーコイルDNAとして試験管内増幅することに成功した。試験管内で染色体丸ごとを壊さずに増幅できたという点は画期的であり、大きな成果である。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

複製サイクル再構成系への転写反応の融合においては、複製と転写の衝突を回避する機構についてのin vitroでの検証を実施することに成功し、in vivoで示唆されていたいくつかの機構が実際に効果あることを実証するに至った。また、それによって効率よく複製と転写の融合系を駆動させることができるようになった。
複製サイクル再構成系への制御系の組み込みにも成功し、DNAメチル化を介した複製開始制御機構の存在が、反応系の振る舞いに興味深い影響を与えることを発見し、更なる解析を進めている。
さらに、染色体を試験管内に取り出して解析するアプローチにおいては、2Mbまでの分断染色体について環状構造を保ったまま壊さずに試験管内で複製サイクル増幅できることを示すことができ、こちらも画期的な成果であると言える。

Strategy for Future Research Activity

複製と転写の融合系に関しては、今後、翻訳反応についても融合を検討し、転写、翻訳された複製タンパク質によって鋳型DNAの複製が導かれる「ゲノム自己複製系」の検討を進める。
複製サイクル再構成系への制御系の組み込みに関しては、複製開始のネガティブフィードバック制御を介したしたサイクルの周期性のようなものが実装されている可能性があり、リアルタイム検出系を用いてその周期性の変動について検出を試みたい。
2Mbまでの分断染色体については細胞内から壊さずに取り出し、環状のまま丸ごと増幅できるようになった。一方で、分断していない天然染色体丸ごと(縮小ゲノム株3Mb)の増幅にはまだ至っておらず、その原因を探り解決することで、ゲノム丸ごと試験管内増幅というインパクトを達成したい。
最終的に、以上の系を全てを一つの反応系として融合することで、細胞内で起きているゲノム動態の基本的な部分を試験管内で再現できるようにすることが目標である。

  • Research Products

    (16 results)

All 2022 2021 Other

All Journal Article (3 results) (of which Peer Reviewed: 3 results,  Open Access: 3 results) Presentation (12 results) (of which Invited: 4 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] In vitro amplification of whole large plasmids via transposon-mediated oriC insertion2021

    • Author(s)
      Nara, S. and Su'etsugu, M.
    • Journal Title

      BioTechniques

      Volume: 71 Pages: 528-533

    • DOI

      10.2144/btn-2021-0068

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Grand scale genome manipulation via chromosome swapping in Escherichia coli programmed by three one megabase chromosomes2021

    • Author(s)
      Yoneji, T., Fujita, H., Mukai, T., and Su'etsugu, M.
    • Journal Title

      Nucleic Acids Res.

      Volume: 49 Pages: 8407-8414

    • DOI

      10.1093/nar/gkab298

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Amplification of over 100 kbp DNA from Single Template Molecules in Femtoliter Droplets2021

    • Author(s)
      Ueno, H., Sawada, H., Soga, N., Sano,M., Nara, S., Tabata, K. V., Su’etsugu, M. and Noji, H.
    • Journal Title

      ACS Synth. Biol.

      Volume: 10 Pages: 2179-2186

    • DOI

      10.1021/acssynbio.0c00584

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] DNA メチル化による大腸菌染色体複製サイクル再構成系の制御2022

    • Author(s)
      加納 巧希、末次 正幸
    • Organizer
      第16回日本ゲノム微生物学会年会
  • [Presentation] 人工ゲノム合成における DNA 配列エラーの解析2022

    • Author(s)
      小山拓也、末次正幸
    • Organizer
      第16回日本ゲノム微生物学会年会
  • [Presentation] 大腸菌染色体複製と転写翻訳の協調的進行2022

    • Author(s)
      奈良聖亜、末次正幸
    • Organizer
      第16回日本ゲノム微生物学会年会
  • [Presentation] 人工ゲノムのセルフリー合成2021

    • Author(s)
      末次正幸
    • Organizer
      バイオインダストリー協会 発酵と代謝研究会
    • Invited
  • [Presentation] 大腸菌のメガサイズゲノムの合成と移植の技術2021

    • Author(s)
      末次正幸
    • Organizer
      第73回 日本生物工学会大会 シンポジウム
    • Invited
  • [Presentation] なぜ今、合成生物学なのか2021

    • Author(s)
      末次正幸
    • Organizer
      日本科学哲学会第54回大会 特別講演
    • Invited
  • [Presentation] メガサイズ染色体のバクテリア細胞への出し入れおよび増幅の技術2021

    • Author(s)
      末次正幸
    • Organizer
      第44回日本分子生物学会年会ワークショップ「細胞核を造る」
    • Invited
  • [Presentation] 大腸菌ゲノムの分断化とポータブル化2021

    • Author(s)
      向井崇人、末次正幸
    • Organizer
      第17回21世紀大腸菌研究会
  • [Presentation] 大腸菌サブ染色体の他細胞への移植2021

    • Author(s)
      吉田光輝、向井崇人、末次正幸
    • Organizer
      第17回21世紀大腸菌研究会
  • [Presentation] 大腸菌ゲノムの試験管内複製2021

    • Author(s)
      藤田裕寛、末次正幸
    • Organizer
      第17回21世紀大腸菌研究会
  • [Presentation] 複製遺伝子群をコードする環状DNAを鋳型にしたセントラルドグマの試験管内再構成2021

    • Author(s)
      川上直貴、長谷部友憲、高田啓、末次正幸
    • Organizer
      第17回21世紀大腸菌研究会
  • [Presentation] 大腸菌染色体複製再構成系と転写・翻訳系との協調2021

    • Author(s)
      奈良聖亜、末次正幸
    • Organizer
      第17回21世紀大腸菌研究会
  • [Remarks] 末次研究室HP

    • URL

      https://www2.rikkyo.ac.jp/web/sue-lab/

URL: 

Published: 2022-12-28  

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