2020 Fiscal Year Annual Research Report
発達期からの慢性ニコチン曝露がもたらす神経回路変容の統合的理解
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20H03410
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
山崎 美和子 北海道大学, 医学研究院, 准教授 (10431305)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
宮崎 太輔 北海道大学, 保健科学研究院, 准教授 (90374230)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | アセチルコリン / ニコチン / 神経伝達 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ニコチン性アセチルコリン受容体(nAChR)は、タバコの主成分であるニコチンと結合することにより様々な神経伝達修飾作用を及ぼす。よく知られたニコチン依存に加え、近年では発達期からのニコチン曝露がオピオイド系を始めとする薬物依存への道筋をつけるという新たな可能性が示唆されているが、その生物学的なメカニズムや脳内でnAChRの局在やその分子機構にも未だ不明な点が多い。本研究ではnAChRを介した神経伝達修飾の解剖学的な基盤を示し、発達期からのニコチン曝露が神経回路にどのような構造的・機能的な変容をもたらすかを明らかにする。今年度は以下の二項目で進捗があった。
1)a7サブユニットに対する特異抗体の開発:脳内の主要サブユニットであるa7サブユニットに関し、生化学解析に使用できる抗体は既に開発していたが、今年度、脳組織での免疫染色に使用可能な特異抗体の開発に成功した。野生型マウスでは、陽性シグナルが大脳皮質第１層や海馬の上昇層の抑制性介在ニューロンや、赤核、二丘体傍核に存在していた。これに対し、a7欠損マウスではシグナルが検出されず、特異性が確認された。また、a7サブユニットのアセンブリに必要なシャペロンTMEM35欠損マウスでもシグナルが検出されなかった。このことはa7の細胞膜への輸送ではなく、アセンブリにTMEM35Aが必須であることを示唆している。また、組織染色に有用というだけでなく、生化学解析での感度・特異度ともに高く今後の解析に非常に有用なツールとして期待できる。
2) b4サブニットに対する特異抗体の開発:b4サブニットに対する特異抗体の開発に成功した。内側手綱核-脚間核投射系に選択的に局在していることが確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度に、今後の解析に有用な複数のツールの開発に成功し、鍵となるデータを得ることができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
1)a7サブユニットの脳内における発現部位の解析
脳内の主要サブユニットであるa7サブユニットに対する特異抗体を用いて発現解析を行う。この際、陽性細胞の神経化学特性や、神経細胞内のどのコンパートメント（細胞体、樹状突起、軸索、神経終末）にいるかが重要な情報となるので、AAVによりGFPを導入する順行性標識と各マーカー分子との多重染色を組み合わせて共焦点レーザー顕微鏡により局在を検討する。
２）その他のサブユニットに対する特異抗体の開発
脳内のnAChRの発現様式の理解を目指し、ユニークなアミノ酸配列を抗原として用いてポリクローナル抗体作成を行う。今年度はa3, a4, a5, a6, b2, b3受容体の抗体作成に着手する。特異性についてはサブユニット欠損マウスサンプルを用いて検討する。開発が成功しないサブユニットについては選択性の高いリボプローブを用いたin situ ハイブリダイゼーションによる細胞発現検討に留まる可能性がある。
３）a7*-nAChR複合体の構成分子・結合分子の同定
特異抗体を使った共免疫沈降により精製する。このサンプルを、非変性状態で複合体構造をとるタンパク質や膜タンパク質複合体の大きさや分子種を調べるために有用な手法であるBlue Native-PAGEによる泳動を行い、切り出したバンドの質量分析により構成サブユニットと受容体結合分子の同定に取り組む。
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Research Products
(10 results)
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[Journal Article] TMEM163 Regulates ATP-Gated P2X Receptor and Behavior.2020
Author(s)
Salm EJ, Dunn PJ, Shan L, Yamasaki M, Malewicz NM, Miyazaki T, Park J, Sumioka A, Hamer RRL, He WW, Morimoto-Tomita M, LaMotte RH, Tomita S.
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Journal Title
Cell Rep.
Volume: 31
Pages: 1-13
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Expression mapping, quantification, and complex formation of GluD1 and GluD2 glutamate receptors in adult mouse brain2020
Author(s)
Nakamoto C, Konno K, Miyazaki T, Nakatsukasa E, Natsume R, Abe M, Kawamura M, Fukazawa Y, Shigemoto R, Yamasaki M, Sakimura K, Watanabe M.
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Journal Title
J Comp Neurol .
Volume: 528
Pages: 1003-27
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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