2020 Fiscal Year Annual Research Report
Intranuclear replication mechanism of influenza A virus
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20H03494
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
野田 岳志 京都大学, ウイルス・再生医科学研究所, 教授 (00422410)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | インフルエンザウイルス / RNP複合体 / 転写・複製 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
インフルエンザウイルスは、8分節にわかれた一本鎖マイナス鎖RNAをゲノムとして持つ。各ゲノムRNA分節（vRNA）は、ウイルスRNAポリメラーゼとウイルス核タンパク質NPとともに、二重らせん構造のribonucleoprotein（RNP）複合体を形成する。RNP複合体は、vRNAの核内移行、vRNAの転写および複製、vRNAの核外移行、vRNAの子孫ウイルス粒子への取り込みに不可欠な構造体であり、ウイルス増殖環において中心的な役割を担う。細胞の核内は、膜構造を伴わずに液-液相分離により多くの区画に分けられており、様々な核内ドメインを含む。しかし、インフルエンザウイルスのRNP複合体形成が感染細胞核内のどのドメインで起こるのかについては、未だ未解明のままである。本研究では、インフルエンザウイルスのゲノムRNAの転写・複製に必須の複合体であるRNP複合体が形成される核内の場を明らかにすることを目的とする。本研究では特に核小体に着目して研究を進めた。本年度はNPの核小体移行シグナルに着目し、その変異体を作製した。核小体移行シグナルに変異を導入したNPは確かに核小体に移行しないこと、その変異体NPはゲノムRNAの転写複製をサポートできないことを確認した。さらに変異体NPを用いて細胞内でRNP複合体を再構成し、精製後、高速原子間力顕微鏡を用いてその形態を解析したところ、変異NPは螺旋状のRNP複合体を形成できないことを見出した。一方で、その変異NPのN末端に核小体移行シグナルを付加した復帰変異体NPは、螺旋状のRNP複合体を形成し、ゲノムRNAの転写複製をサポートすることを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
インフルエンザウイルスは、8分節にわかれた一本鎖マイナス鎖RNAをゲノムとして持つ。各ゲノムRNA分節（vRNA）は、ウイルスRNAポリメラーゼとウイルス核タンパク質NPとともに、二重らせん構造のribonucleoprotein（RNP）複合体を形成する。RNP複合体は、vRNAの核内移行、vRNAの転写および複製、vRNAの核外移行、vRNAの子孫ウイルス粒子への取り込みに不可欠な構造体であり、ウイルス増殖環において中心的な役割を担う。細胞の核内は、膜構造を伴わずに液-液相分離により多くの区画に分けられており、様々な核内ドメインを含む。しかし、インフルエンザウイルスのRNP複合体形成が感染細胞核内のどのドメインで起こるのかについては、未だ未解明のままである。本研究では、インフルエンザウイルスのゲノムRNAの転写・複製に必須の複合体であるRNP複合体が形成される核内の場を明らかにすることを目的とする。本研究では特に核小体に着目して研究を進めた。
初めに、核小体移行シグナルをアラニン置換した「変異体NP」、変異体NPのアミノ末端に核小体移行シグナルを付加した「復帰変異体NP」を発現するプラスミドを作出し、それらNPの核内局在を蛍光抗体法で解析した。その結果、「変異体NP」は核質にのみ局在し、「復帰変異体NP」は野生型NPと同様に、核質だけでなく核小体にも局在することを確認した。次に「野生型NP」、「変異体NP」あるいは「復帰変異体NP」をウイルスRNAポリメラーゼ（flag-PB2・PB1・PAタンパク質）とともに培養細胞で発現させ、RNP複合体を再構成した。高速AFMを用いて再構成したRNP複合体の微細構造を解析したところ、「野生型NP」と「復帰変異体NP」を用いた場合のみ正常な二重らせん構造を持つRNP複合体が形成されることを確認した。
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| Strategy for Future Research Activity |
NPの核小体移行シグナルへの変異導入はウイルス増殖に致死的であったため、そのような変異ウイルスをリバースジェネティクスで作出して解析に用いることはできない。従って、ウイルス感染系においては、正常な核小体がRNP複合体形成に重要であること、核小体に局在する宿主タンパク質がRNP複合体形成に関与すること、核小体で新規ウイルスRNAが合成されることを示すことで、核小体でRNP複合体が形成されることを示す計画である。初めに宿主RNA Polymerase I 阻害薬を用いて、ウイルス感染細胞の核小体形成・維持を阻害する。細胞毒性を示さない、かつ、ウイルスタイターが減少する薬剤濃度を条件検討する。RNA polymerase I の特異的な阻害（新規pre-rRNA mRNA合成量の低下）の確認は、pre-rRNA mRNAのエクソン領域およびイントロン領域に対するプライマーを用いたRT-PCRで確認する。条件検討により適切な薬剤濃度を決定後、ウイルス感染細胞を薬剤処理し、 qRT-PCR法によりvRNAから転写されたmRNA量ならびにvRNAから複製されたcRNA量およびvRNA量を定量する。また、感染細胞からRNP複合体を免疫沈降し、グリセロール密度勾配遠心法により精製後、高速原子間力顕微鏡法によりRNP複合体形成能を評価する。
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Research Products
(6 results)
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[Journal Article] A novel aqueous extract from rice fermented with Aspergillus oryzae and Saccharomyces cerevisiae possesses an anti-influenza A virus activity.2021
Author(s)
Shoji M, Sugimoto M, Matsuno K, Fujita Y, Mii T, Ayaki S, Takeuchi M, Yamaji S, Tanaka N, Takahashi E, Noda T, Kido H, Tokuyama T, Tokuyama T, Tokuyama T, Kuzuhara T.
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Journal Title
PLoS One
Volume: 16
Pages: e0244885
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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