2021 Fiscal Year Annual Research Report

Development of CAR-T cell therapy complementary system for rhabdomyosarcoma using oncolytic virus

Research Project

Project/Area Number	20H03532
Research Institution	Kyoto Prefectural University of Medicine
Principal Investigator	細井創京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 特任教授 (20238744)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	柳生茂希京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (10572547) 吉田秀樹京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (10643546) 家原知子京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (20285266) 菊地顕京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 特任講師 (40453104) 中屋隆明京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (80271633)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	腫瘍溶解性ウイルス / CAR-T療法 / エフェクターサイトカイン
Outline of Annual Research Achievements	【背景】本研究では、エフェクターサイトカインを分泌し、CAR-T細胞を活性化させるOAdを開発することでRMSに対する特異的CAR-T細胞（RMS-CAR-T）治療の効果を強化するOAdを開発し、より効果的な抗腫瘍作用を発揮する複合的細胞遺伝子治療法を開発することを目的とする。【方法】①CAR-T細胞を活性化させるエフェクターサイトカイン分泌型OAdの開発。②抗腫瘍核酸を搭載したsi-Foxp3分泌型OAdの開発。③CAR-T細胞の抗腫瘍効果を最大限に高める、”Armed-OAd”併用遺伝子細胞治療の開発【成果】①IL15がRMS-CAR-Tに及ぼす影響の評価:pcDNA3.1発現ベクターを用いてIL15を発現するRMS細胞株（IL15-Rh30）を作製した。またpuromycinにてセレクションを行い、ELISA法によりIL15が発現していること確認した。RMS-CAR-TとIL15-Rh30、野生型のRh30とをそれぞれ共培養し、real time analyzerでRh30に対する抗腫瘍効果の評価を試みた。しかし、系が中々安定せず、後にIL15が安定して発現していないことが判明したため、①のIL15-RMSの作製からやり直す必要が生じた。具体的にはpcDNA3.1発現ベクターの代わりにIL15を組み込んだトランスポゾンプラスミドをエレクトロポレーション法でRh30に導入した。これにより安定してIL15を発現するRh30の作成を試みている。②研究者の末梢血を用いて、CD4陽性T細胞を単離し、Tregへの分化・誘導が可能であることを確認した。しかし、SiRNAを用いてTregのFOXP3のノックダウンを試みたが、ポジコンであるJurkatほどのKD効率が得られなかった。別のSiRNAやCrispr Cas9を検証中である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason 本プロジェクトは令和2年度に新型コロナウイルスの影響を受け、遅れを取った。さらに今年度は2つの原因で計画に遅れが出た。 ①「研究実績の概要」でも述べたがIL15-RMSの作製において、IL15を安定発現させる点で、CD19-RMSの作製からやり直すことになったため、時間を要した。これに関しては、令和3年度内にIL15を組み込んだトランスポゾンプラスミドをエレクトロポレーション法でRh30に導入することで、安定してIL15を発現するRh30を作成することに成功しており、リカバー可能と考えている。②また、米国のラボから送ってもらったアデノウイルスのバックボーンプラスミドが上手くワークせず、ウイルス作製に支障が出た。一部コマーシャルベースのものに切り替えて対応試みている。どうしても必要なウイルスについてはカルタヘナ法をクリアした上で、米国から輸入することも選択肢に挙がっている。いずれも遅れを取り戻すべく全力を出す所存である
Strategy for Future Research Activity	すでにRMS-CAR-Tを当研究室で安定して作成する技術は確立している。本年度は以下の流れで研究に取り組む： ①IL15-RMSの作製:CD19を組み込んだトランスポゾンプラスミドをエレクトロポレーション法でRh30に導入しCD19を発現するRMS細胞株（Rh30）を作製した。これはフローサイトメトリーによりCD19の発現を確認済である。②IL15-Rh30とRMS-CAR-Tの共培養:IL15-Rh30および、野生型のRh30とCD19 CAR-Tを共培養し、real time analyzerでRh30に対する抗腫瘍効果の評価を改めて試みる。③IL15-OAdの開発。MYOGプロモーター制御型OAdをもとに、E1geneの後にIL15をつないだコンストラクトをいくつか作製し、ウイルスとしてassemble可能か検証する。④IL15-OAdによる、RMS-CAR-Tの抗腫瘍効果の検証。ウイルスが作製でき次第、CAR-Tとの併用効果をin vitro, in vivoで検証する予定である。コロナの流行など不確定な要素があるが、最終的にプロジェクトを遂行するため全力を尽くす。