Comprehensive analyses of time-specific mechanisms of spermatogonial stem cell development and novel strategy for reproductive medicine

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20H03816
• Research Institution: Nagoya City University
• Principal Investigator: 水野 健太郎 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 准教授 (70448710)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 神沢 英幸 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 研究員 (00551277) ; 加藤 大貴 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 研究員 (00620931) ; 西尾 英紀 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 助教 (10621063) ; 林 祐太郎 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (40238134) ; 安井 孝周 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (40326153) ; 岩月 正一郎 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 助教 (70595397) ; 梅本 幸裕 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (80381812)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 精子幹細胞 / 停留精巣 / 男性不妊症

Outline of Annual Research Achievements

本研究課題では、精子形成に重要な役割を持つ「精子幹細胞」の分化メカニズムと男性不妊症における幹細胞の挙動を明らかにし、生殖医療への応用をめざすことを目的とする。そのため、（研究Ⅰ）幼若精巣における精子幹細胞分化にかかわる因子の同定、（研究Ⅱ）成熟精巣における精子幹細胞の特異的形質変化の解析、（研究Ⅲ）幹細胞ニッチ構成細胞とニッチ形成因子の解析、を行う。精子幹細胞の分化異常をきたす停留精巣を対象として、それらの精巣組織の解析を進めている。
本年度は、当院で精巣固定術を施行した症例を対象として、精巣組織の病理組織学的検討を行なった。従来のDDX4抗体を用いた免疫染色だけでなく、ID4抗体を用いた免疫染色も行なった。DDX4は精子形成細胞に広く発現するが、ID4は幹細胞により特化したマーカーであることが近年報告されている。また、停留精巣の組織学的検討から、精子幹細胞の分化異常をきたした症例とそうでない症例が混在していることが明らかとなった。
さらに、研究Ⅱに関連して、思春期の精巣組織を解析するため、停留精巣モデル動物の精巣組織を詳細に検討したところ、精子形成細胞を支持するSertoli細胞間に形成される血液精巣関門（Blood-Testis Barrier：BTB）が形成障害を起こすことを見出した。特に、BTBの代表的な構成タンパク質であるCLDN11の発現様式が異なることを蛍光免疫染色で明らかにした。また、電子顕微鏡を用いた解析から、BTBの機能も妨げられており、その精細管に一致して精子形成細胞のアポトーシスが起きていることも明らかとした。
また研究Ⅰに関連して、精巣の体外培養系の作成を効率的に行うための培養条件の検討・組織培養のための専用のゲル作成などを行なった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当初の研究計画では、ヒト停留精巣を対象とし、出生後の定期的な性ホルモン（LH, FSH, インヒビンB, AMHなど）の採血を行い、その後、手術治療を行なった症例をmini-pubertyの有無によって2群に分けて検討を行う予定であった。しかし、新型コロナウィルス感染症の蔓延に伴う社会情勢の変化から、停留精巣を含めたカテゴリーの手術は優先度が他カテゴリーの手術（主に、がん治療）に対して低いことから、私たちの施設では手術治療が行えず、思うように症例の集積が進まなかった。同様に、成人の不妊症症例についても、手術治療が行えない環境が継続したため、こちらも症例の集積が進まなかった。そこで、これまでに手術治療を行なった過去の症例（特に停留精巣）について、保存検体での解析を行なった。また、文献検索など情報収集も積極的に行い、自らの知見と合わせ、停留精巣組織における精子幹細胞の分化にばらつきが見られることを観察することができた。

Strategy for Future Research Activity

新型コロナウィルス感染症による社会情勢は依然として変わらず、症例の集積が計画通りに進まないことも予想されるため、研究計画のうち、実験動物を用いた研究を精力的に進めていく。当初の研究計画のうち、研究Ⅱでは造精機能障害モデル動物の精巣組織を体外培養して精子幹細胞の挙動を確認することを予定している。すなわち、モデル動物の精巣組織を摘出し、1-3mm角に細切したのち、MEMα, GlutaMax, KSRを含む培地・アガロースゲル上で気相液相鏡面培養を行う。使用する精巣組織は、胎児期および出生直後から生後1-7日までの幼若なものを使用する。
また、培養開始の日齢が異なることで、その後の培養結果にどのような影響があるかについても検討したい。並行して、精巣を分散して構成細胞の特性、特に表面マーカーに対する特異抗体を用いたフローサイトメトリーを行い、日齢別の構成細胞の割合の変化についても検討を行う。
新型コロナウィルス感染症に対するワクチン接種など、社会情勢の変化に伴い、停留精巣・男性不妊症に対する手術治療が進むことも予測し、症例の集積については継続的に行なっていきたい。

Research Products

• [Journal Article] Disorganization of claudin-11 and dysfunction of the blood-testis barrier during puberty in a cryptorchid rat model. (2020)
  • Author(s): Kato T, Mizuno K, Nishio H, Moritoki Y, Kamisawa H, Kurokawa S, Nakane A, Maruyama T, Ando R, Hayashi Y, Yasui T
  • Journal Title: Andrology Volume: 8 Pages: 1398-1408
  • DOI: 10.1111/andr.12788
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Guidelines for the medical management of pediatric vesicoureteral reflux. (2020)
  • Author(s): Miyakita H, Hayashi Y, Mitsui T, Okawada M, Kinoshita Y, Kimata T, Koikawa Y, Sakai K, Satoh H, Tokunaga M, Naitoh Y, Niimura F, Matsuoka H, Mizuno K, Kaneko K, Kubota M
  • Journal Title: International Journal of Urology Volume: 27 Pages: 480-490
  • DOI: 10.1111/iju.14223
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Appropriate timing of performing abdominal ultrasonography and termination of follow-up observation for antenatal grade 1 or 2 hydronephrosis. (2020)
  • Author(s): Nakane A, Mizuno K, Kato T, Nishio H, Kamisawa H, Kurokawa S, Maruyama T, Yasui T, Hayashi Y
  • Journal Title: BMC Urology Volume: 20 Pages: 178
  • DOI: 10.1186/s12894-020-00750-y
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Genetic and histopathological analysis of Transverse testicular ectopia without persistent Mullerian duct syndrome: two case reports. (2020)
  • Author(s): Nagai T, Mizuno K, Usami M, Nishio H, Kato T, Nakane A, Matsumoto D, Kurokawa S, Kamisawa H, Maruyama T, Yasui T, Hayashi Y
  • Journal Title: Journal of Medical Case Report Volume: 14 Pages: 233
  • DOI: 10.1186/s13256-020-02559-7
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Robot-Assisted Radical Cystectomy for Pediatric Bladder Rhabdomyosarcoma. (2020)
  • Author(s): Nishio H, Mizuno K, Kawase K, Kato T, Kamisawa H, Kurokawa S, Nakane A, Ando R, Maruyama T, Yasui T, Hayashi Y
  • Journal Title: Journal of Endourology Case Report Volume: 6 Pages: 461-464
  • DOI: 10.1089/cren.2020.0116
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Surgical outcomes and properties of laparoscopic and robot-assisted laparoscopic ureteral re-implantation in pediatric patients with vesicoureteral reflux: a comparative study. (2020)
  • Author(s): Mizuno K, Nishio H, Kato T, Nakane A, Maruyama T, Tozawa K, Yasui T, Hayashi Y
  • Organizer: Society for Pediatric Urology’s 68th Annual Meeting
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Potential role of EEF1A1 and TPT1 genes expressed in the spermatogonial stem cells as a predictive factor of subsequent testicular growth. (2020)
  • Author(s): Mizuno K, Nishio H, Kato T, Kamisawa H, Moritoki Y, Kurokawa S, Nakane A, Maruyama T, Yasui T, Hayashi Y
  • Organizer: AUA 2020 Annual Meeting
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 停留精巣の造精機能障害における血液精巣関門の意義 ーCLDN11タンパク発現と超微細構造の解析ー (2020)
  • Author(s): 加藤大貴、水野健太郎、西尾英紀、安井孝周、林祐太郎
  • Organizer: 第108回 日本泌尿器科学会総会
• [Presentation] 小児泌尿器科領域の基礎研究の現状と展望 (2020)
  • Author(s): 水野健太郎、西尾英紀、加藤大貴、中根明宏、丸山哲史、安井孝周、林祐太郎
  • Organizer: 第108回 日本泌尿器科学会総会
• [Presentation] 精細管ステージ特異的なapical ectoplasmic specializationの遺伝子発現解析 (2020)
  • Author(s): 武田知樹、岩月正一郎、野崎哲史、西尾英紀、窪田裕樹、神谷浩行、水野健太郎、最上徹、林祐太郎、梅本幸裕、安井孝周
  • Organizer: 第108回 日本泌尿器科学会総会