2020 Fiscal Year Annual Research Report

内有毛細胞・蝸牛神経間シナプスをターゲットとした聴覚再生治療の新規開発

Research Project

Project/Area Number	20H03833
Research Institution	Yamagata University
Principal Investigator	欠畑誠治山形大学, 医学部, 教授 (90261619)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	伊藤吏山形大学, 医学部, 准教授 (50344809) 窪田俊憲山形大学, 医学部, 講師 (80536954) 小泉優山形大学, 医学部, 非常勤講師 (80723585) 杉山元康山形大学, 医学部, 医員 (60637255) 寺田小百合山形大学, 医学部, 医員 (40795697) 天野彰子山形大学, 医学部, 医員 (50787249)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	内耳 / 聴神経 / 内有毛細胞 / シナプス / cochlear synaptopathy / シナプス再生 / 再生医学 / ROCK阻害薬
Outline of Annual Research Achievements	難聴を引き起こす三大原因は、騒音暴露、薬物、そして加齢である。最新の研究により、音響性や薬剤性、加齢性聴覚障害の初期病変として内有毛細胞と蝸牛神経間のシナプス病理、Cochlear Synaptopathy（primary neural degeneration）の病態が注目されている。本研究では、Cochlear Synaptopathyモデルマウスを作成し、内耳障害における内有毛細胞・蝸牛神経間のシナプス再生の可能性を検討する。現在は神経保護効果および神経・シナプス再生作用を有するとされるROCK阻害薬に着目し検討を行っている。ROCK阻害薬は緑内障や脳血管攣縮の分野では保険適応薬剤としてすでに臨床応用されており、本研究により聴神経障害に対して有効性が確認できた場合、聴覚障害に対する画期的な治療薬として内耳再生研究のブレークスルーとなることが期待される。これまでのex vivo実験系を用いた先行研究で神経障害モデルに対するROCK阻害薬の効果を確認していたが、前年度の研究でPCRによるRho-ROCK経路の障害前後の発現変化を確認し、結果をまとめて国際論文発表をおこなった。引き続きROCK阻害薬の蝸牛神経障害に対する再生効果をin vivo実験系で検討するために、機能評価に必要なDPOAEを購入したが、新型コロナウイルス流行による緊急事態宣言発令に伴い設置に必要な技術員の移動が制限されたため、本格的な稼働開始が年度末となってしまった。このため当初の予定よりも遅れが生じてしまったが、現在はCochlear synaptopathyモデルの作製、評価が行える環境が整ったため、音響障害によるモデル動物の作製、評価を行っている段階である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason ROCK阻害薬の蝸牛神経障害に対する再生効果をin vivo実験系で検討するために、機能評価に必要なDPOAEを購入したが、新型コロナウイルス流行による緊急事態宣言発令に伴い設置に必要な技術員の移動が制限されたため、本格的な稼働開始が年度末となってしまった。このため当初の予定よりも遅れが生じてしまったが、現在はCochlear synaptopathyモデルの評価が行える環境が整ったため、音響障害によるモデル動物の作製、評価を行っている段階である。我々は以前から種々の音響障害モデルの作成を行っていたため、障害モデルの作製は比較的スムーズに進むことが期待される。また、前年度より防衛医科大学校の水足らとの共同研究を開始し、laser-induced shock wave(LISW)を用いたCochlear synaptopathyモデルに対するROCK阻害薬の効果の検討も開始した。本共同研究に関しては、前年度の進歩により動物モデルの使用準備がほぼ整った状態となったため、引き続きROCK阻害薬投与による影響を解析する予定である。
Strategy for Future Research Activity	音響障害モデルはこれまでの報告をもとに作製する。まず88dBまたは98dBまたは108dBで2時間または4時間など、いくつかの条件で検討を行い、障害の程度の調整を行う。音響暴露後24時間で一過性閾値上昇を確認する。作製した障害モデルが適正かどうかは、DPOAEおよびABRの閾値回復後にABRのI波振幅で確認する。音響またはLISWによって得られた障害群を、生食局所投与群、ROCK阻害薬局所投与群、ROCK阻害薬全身投与群3群に分け、その後の解析の対象とする。障害モデルにROCK阻害薬を局所あるいは全身投与した後の、薬剤効果判定を行う時期としては、およそ2週間前後での評価を予定している。障害モデルの評価には正常群と障害群の比較評価、治療効果判定には障害群(生食投与コントロール)と治療群(ROCK阻害薬局所投与、ROCK阻害薬全身投与) の比較検討を行う。1. 障害前の機能評価、2. 障害暴露、3. 24時間後に機能評価を行い、一過性閾値上昇を示した個体を選別し形態学的評価、4. 各グループに振り分けて薬剤投与、5. 治療後の機能評価・形態学的評価の流れで行う。機能評価としては主にABRとDPOAEによる解析を行う。形態学的評価としては免疫化学組織法を行い、有毛細胞マーカーとしてRabbit anti- Myo7a、聴神経マーカーとしてChicken anti-NF200、前シナプスマーカーとしてMouse (IgG1) anti-CtBP2、後シナプスマーカーとしてMouse (IgG2a) anti-GluA2を使用した多重染色により解析する。共焦点レーザー顕微鏡を用いて3次元的な内有毛細胞、蝸牛神経線維、前シナプス、後シナプスの位置関係を確認する。